第3章分子荧光分析法.pptVIP

一、 荧光分析的基本原理 二、荧光分析仪 三、分子荧光分析法及其应用 3.1 荧光分析的基本原理 3.1 荧光分析的基本原理 3.1.2 激发光谱和发射光谱 荧光激发光谱与发射光谱的特征 （2）具有大的共轭π键结构 （3）具在刚性平面结构 3）介质酸度的影响 3 溶液荧光的猝灭 3.3.3 荧光定量分析 * * 第三章 分子荧光分析法 molecular fluorescence analysis 1575：西班牙植物学家N.Monardes观察到荧光现象 1852：Stokes 研究荧光，提出作为一种分析手段 1867：Goppelsroder首次应用方法 1880：提出荧与化学结构关系的经验法则 1928：Jette和West 第一台光电荧光计 1952：第一台商品化的荧光分光光度计 特点： 1)灵敏度高（1-100 ppb)：有的可达0.01ppb； 2)选择性强； 3)方法简单快速，用样量少; 4)提供比较多的物理参数。 3.1 荧光分析的基本原理 分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能 等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。 荧光和磷光: 当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的特殊性，会发出比吸收波长更长的不同波长的可见光，当紫外光照射停止时, 随之消失的光叫做荧光，不立即消失的光叫磷光。 分子能级=电子能级(Ee)+振动能级(Ev)+转动能级(Er)。 电子激发的多重度：M=2s+1 Pauli不相容原理：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。 单重态: 如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的, s=0, M=1 三重态：电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，s=1,M=3 S0 S1 S2 T1 T2 3.1.1分子发光的产生 去活化 发射光子 非辐射跃迁 化学反应 荧光 磷光 振动驰豫 系间跨越 内转换 外转换 激发光去除后，荧光立即消失 激发光去除后，磷光不会立即消失 熄灭或猝灭 3.1 荧光分析的基本原理 3.1.1分子发光的产生 激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！ 发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。 荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？ 吸收池 光源 检测器 单色器 信号显示系统 单色器 a.Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 分子被激发到高于S1的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到S1电子态的最低振动能级 尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与荧光体被激发至哪一个电子态无关。 无论激发波长是λ1还是λ2，荧光的波长都是λ?2 3.1.2 激发光谱和发射光谱 激发光谱的形状与发射波长也无关 ?ex =290nm (MAX) 固定?em=620nm(MAX) 固定?ex=290nm (MAX) ?em= 620nm(MAX) S0 4 3 2 1 S1 4 3 2 1 1→ 4 1→ 3 1→ 2 1→1 1 → 4 1 → 4 1 → 2 1 → 1 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似； 基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等 200 250 300 350 400 450 500 荧光激发光谱 荧光发射光谱 nm 蒽的激发光谱和荧光光谱 3.1.3 荧光与分子结构的关系 分子荧光产生的必备条件 分子必须能够吸收激发光 分子必须具有一定的荧光量子产率 影响因素：荧光产生过程中， 辐射和无辐射过程； 与每一过程的速率常数有关； kf 分子结构决定（内因）； 主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。 ???? n??? 振动弛豫 激发 ??? ? ??