1蛋白质的结构功能.ppt

（一）透析及超滤法 * 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 * 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。 透析 (Dialysis) （二）有机溶剂沉淀、盐析及免疫沉淀 * 有机溶剂：常用丙酮、乙醇等沉淀，浓度不能太高，低温 * 盐析(salt precipitation)是将高浓度中性盐如硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 agarose bead 免疫沉淀法（IP） 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G”能特异结合免疫球蛋白FC片段的现象而发展的方法。目前多用精制的protein A/G预先结合固化在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。 protein A 抗原 抗体 （三）电泳 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。 几种重要的蛋白质电泳 * SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）， 常用于蛋白质分子量的测定。 * 等电聚焦电泳（IEF）， 通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 * 双向凝胶电泳（2D-gel）是蛋白质组学研究的重要技术。 Electrophoresis Estimating the molecular weight of a protein Marker （SDS） Isoelectric focusing （IEF） Two-dimensional electrophoresis 蛋白质组学研究的重要技术之一 （四）层析 (chromatography) 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 蛋白质分离常用的层析方法 离子交换层析(ion exchange chromatography)：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography):又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。 此外还有亲和层析(Affinity chromatography), 疏水层析(Hydrophobic interaction chromatography), 高效液相层析(High-performance liquid chromatography)等。 gel filtration chromatography Separates proteins by size Ion-exchange chromatography Separates proteins by charge Separates proteins by their binding specificities Affinity chromatography （五）超速离心 * 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 （六）多肽链中氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 7. 蛋白质空间结构测定 Spatial structure determination * 二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而?-折叠的CD谱不很固定。