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PCR-RFLP 基因分型方法 关于序列查找、引物设计和酶切位点分析 http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ 定点诱变引物设计（二） 5-ggattcagaatgattctctccaagaaaacatcctttttggatg-3 3-cctaagtcttactaagagaggttcttttgtaggaaaaacctac-5 酶切位点分析 新建窗口 酶切位点分析 输入序列，注意粘贴的序列不能有空格和段落标记符号 大写突变位点以便于辨认 * * 概念 聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析 限制性片段长度多态性(restrition fragment length polymophism，RFLP): 是指由限制性酶切位点间的插入﹑缺失﹑重排或 点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。 PCR-RFLP: 是在 PCR 和 DNA 序列分析基础上产生的 RFLP 技术。该方法是通过 PCR 扩增一段 DNA 片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化 PCR 产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。 概念 概念 确定基因序列 设计引物 选择内切酶 电 泳 基 因 型 Step by step 基因序列查找 http://www.genomatix.de/ /Genbank /sprot/ 基因序列查找 选择 gene 输入基因名称 基因序列查找 基因的全称 基因的物种来源 引物设计 引物设计 引物一般原则 基本原则： 1. 引物要跟模板紧密结合， 2. 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在， 3. 引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。 需要考虑的因素： 引物长度（primer length）、 产物长度（product length）、 序列Tm值(melting temperature)、 ΔG值(internal stability)、 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false priming site）、 引物及产物GC 含量（composition） 引物一般原则 引物的长度：15-30bp，常用的是18-27bp 太短：特异性不好 太长：延伸温度大于Taq酶的最适温度 引物末端要求：3’端的序列要比5’端重要， 引物3’端的碱基一般不用A A在错误引发位点的引发效率相对比较高 ， 5’端序列对PCR 影响不大，常用来引进修饰位点或标物。 引物的GC含量 ：一般为40-60%，以45-55％为宜 两条引物之间的GC含量不宜相差太大 引物一般原则 Tm 值：尽量保证两条引物的Tm值相匹配。最 好相差不要大于5 度 引物二聚体及发夹结构的能量：绝对值一般不要超过4.5 最好不要位于3’末端 否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行 ，如果在5’末端对反应就没有多大的影响了 ΔG值: 反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的 ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高而 3’端ΔG值相对较低，且不要超过9。如此则有利于正确引 发反应而可防止错误引发 PCR-RFLP 引物特殊要求 PCR产物的长度：200-1000bp 酶切后产物片断的大小差距：100bp以上 引物设计 工欲善其事，必先利其器 Primer Premier 5.0 引物设计 Oligo 6.0 引物评价 引物设计 新建窗口 输入序列 Primer Premier 5.0 突变位点 选取突变位点前后约500bp长度的碱基 Primer Premier 5.0 引物设计 酶切位点分析 Primer Premier 5.0 自动搜索引物 手动编辑引物 Primer Premier 5.0 前引物的位置（必须超过突变位点） 后引物的位置（必须在突变位点之后） PCR产物的长度 引物的长度 Primer Premier 5.0 引物的综合评分，分越高引物越好 引物的详细信息 引物序列 Primer Premier 5.0 发夹结构 二聚体 错配 交叉二聚体 Primer Premier 5.0 更高级应用： 参数的设置 手动搜索或者修改引物 搜索特殊引