蔗糖酶理论讲授813.pptVIP

三、实验步骤及原理 1、蔗糖酶的提取 2、蔗糖酶的纯化 3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定 4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定 5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响 6、蔗糖酶酶促反应动力学研究 7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 1、蔗糖酶的提取 (细胞破壁) 自溶法破壁（本实验） 干酵母粉 溶于蒸馏水 乙酸钠 乙酸乙酯 35℃恒温 搅拌40分钟 35℃恒温过夜 补加蒸馏水 搅拌均匀，成糊状 离心 弃沉淀及脂层 E1 记录生产厂家和批号 用硫酸纸封严（过夜） 2、蔗糖酶的纯化 1. 酶的蛋白属性； 2. 调节酶溶解度的方法； 有机溶剂分级沉淀 3. 根据酶分子大小、形状不同的分离方法； 透析、凝胶层析 4. 根据酶分子电荷性质的分离方法； 离子交换层析 5. 根据酶分子专一性结合的方法; 酶的纯化方法 2. 调节酶溶解度的方法； 酶的纯化方法 （1）改变离子强度； 盐溶 / 盐析 硫酸铵分级沉淀（反抽提法） （2）改变pH或温度； （3）改变介电常数； 有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。 有机溶剂分级沉淀操作条件的控制 溶剂选择 常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。 温度 使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。 样品浓度的控制 一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5%-2% 为好。 3. 根据酶分子大小、形状不同的分离方法； 酶的纯化方法 （1）离心分离； （2）透析、超滤； （3）凝胶层析 （gel chromatography） 凝胶层析的定义： 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 凝胶层析 常见名称：凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析。 凝胶层析的基本原理 凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。 在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。 4. 根据酶分子电荷性质的分离方法； 酶的纯化方法 离子交换层析 基本原理 ： 以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。 在介质中带正电的物质用阳离子交换剂；带负电物质用阴离子交换剂 3、蔗糖酶的活性测定 酶活力 (enzyme activity) 酶催化某一反应的能力——V V——单位时间内单位体积中 底物 (substrate) 的减少量或 产物 (product) 的增加量 国际单位（IU）：在特定的条件下，每分钟催化1μmol 底物转化为产物所需的酶量。 催量单位（kat）：在特定条件下，每秒钟使1mol底物转 化为产物所需的酶量。 1 IU= 16.67×10-9 kat 酶活力单位： 2、酶活力和比活力表示方式 活力 (或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而比活力是酶纯度的量度，是每毫克酶的催化活力数 (U/mg蛋白)。在酶的纯化过程中它的比活力逐渐升高，当酶提纯时，其比活力值成为最大和恒定。 酶的比活力 (specific activity，也称比活性） 比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示。 比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml） 比活力有时也可用每g或每ml 酶含多少个活力单位来表示 DNS 法测定蔗糖酶活力（本实验） 1、 3,5-二硝基水杨酸比色定糖的原理： 2） 在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系（可于比色测定），所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。 1） 2、 蔗糖酶活力测定的原理： 1）