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第四章 细胞融合 与 单克隆抗体 Cell Fusion and Monoclonal Antibodies 第一节 细胞融合 定义：指将不同来源的原生质体相融合，并使之分化再生、形成新物种或新品种的过程，又称为体细胞杂交 第一节 细胞融合 原理： 植物细胞-去细胞壁(酶消化) 动物细胞-分散(酶消化) -单个原生质体-诱导融合-筛选 关键：建立细胞桥 一、细胞融合剂 二、细胞融合方式 完整细胞之间的融合 核体、胞质体与完整细胞的融合作用 微小细胞与完整细胞的融合 脂质体介导的细胞融合 三、细胞融合技术 生物法（病毒诱导融合） 化学法（化学剂诱导融合） 物理法（电融合） 化学法：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 原理： ①促使细胞凝结 （负电荷作用） ②破坏接触处细胞膜 （被洗脱） 影响因素： 分子量：4000—6000 浓度： 20—60% （通常：30—50%） pH： 偏碱为宜（pH7.4—8.0） 其他： 二甲亚砜、植物血凝素 物理法：细胞电融合 原理： 细胞在电场中极化成偶极子，并排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜。 甜菜原生质体电融合过程 注意事项 1）介质要求高 2）控制电压的强度和时间 优点： 融合率高 融合率＝（融合组多核细胞的核数－对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）×100％ 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞 四、杂种细胞的筛选 原理： 两种亲本细胞融合混合物中可有多种类型细胞，筛选目的是获得优良杂种细胞。 同核体 异核体 多核体 异胞质体 核质体 1 植物细胞筛选方式 1）遗传互补筛选法 如 亲本1： 叶绿体缺陷型 亲本2： 光致死型 融合细胞：正常 2）抗性互补筛选法 如：亲本1：放线菌素D＋，MS－ 亲本2：放线菌素D－，MS＋ 杂种细胞：放线菌素D＋，MS＋ 而亲本和其它细胞死亡 3）利用物理特性筛选法 亲本1：异硫氰酸荧光素（FITC）标记 亲本2：碱性蕊香红荧光素标记 荧光显微镜下，亲本1：绿色，亲本2：红色，杂种细胞可以区分 4）利用生长特性筛选法 如粉兰烟草与朗氏烟草细胞：外源激素 融合细胞：内源激素 动物细胞的筛选方式： 1）利用抗药性筛选系统 亲本A：Amp－，Kan＋ 亲本B：Kan－，Amp＋ 杂种细胞： Amp＋ ，Kan＋ 2）营养互补筛选系统 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，亲本细胞均死亡。 3）温度敏感突变型 亲本一：Kan＋，37度 亲本二：高温敏感突变型，Kan－ 杂种细胞能在高温和含Kan培养基生长。 抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质。 二、单克隆抗体的制备 杂交瘤技术：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。 单克隆抗体(monoclonal antibody，简称McAb)：单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子。 单抗的特点 1.高度特异性 2.高度稳定性 3.高抗体活性 4.不可知性 5.过于单一性 单抗的制备原理 1.病毒转化 2.细胞杂交 单抗的制备过程 1.动物免疫与亲本选择 2.细胞融合 3.杂交瘤细胞的筛选 4.单抗制备和冻存 5.单抗纯化 1.动物免疫与亲本选择 1）骨髓瘤细胞 一般不分泌抗体 能在体外无限繁殖和连续继代培养 为HPRT－或TK－。 多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。 2）淋巴细胞 免疫方法 体内法 体外法 2.细胞融合 脾细胞和骨髓细胞混匀 离心 沉淀滴加50%的PEG 0.5ml 静置90秒 滴加不含血清培液或BSS 5－10ml 静置10分钟 3.HAT培养基筛选杂交瘤细胞 细胞团块分散，加HAT溶液，稀释 加入有饲细胞的多孔培养板 2－3天半量换液，7天后完成 1）HAT选择系统 HAT：是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。 DNA合成途径有两种。 原理： 杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一，无补救途径。 含氨基喋呤培养基抑制了全合成途径。 淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。 杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。 在HAT培养基中，HPRT- 或TK- 亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。 2）特异性杂交瘤细胞的筛选 可溶性抗原:放射免疫、免疫酶标测定等 细胞抗原:免疫荧光、被