质粒的提取和鉴定DNA酶切.pptVIP

酶切反应中应注意以下几个问题： 1. 内切酶：不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点和形成的粘性末端； 2. 内切酶的用量：根据内切酶的单位和DNA用量而定。使用中一般以1 μg DNA用2-3U酶进行酶切为宜； 3. 内切酶体积：不能超过反应体系的10%，因内切酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切酶的活力； 4. 操作条件：反应体系配置应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。 5. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。 反应缓冲液： 1. 反应缓冲液: 主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+ 为内切酶的辅基； A. Tris-HCl维持反应体系的PH值在7.2~7.6之间； B. NaCl浓度： 低盐(10mM NaCl) 中盐(50mM NaCl) 高盐(100mM NaCl) 2. 酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37℃，如EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ等，也有如BclⅠ需在50℃下进行反应。 3. 酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是酶/DNA＝2~3，12小时即可充分酶解。 4. 酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下 ， 0.05mL反应混合物中, 1小时消化1μg底物DNA的酶量为1单位(1U)。 双酶切实验材料 限制性内切酶：EcoRⅠ、XbaⅠ和HindⅢ DNA：λDNA和质粒pCDNA-p38 10×buffer H （37℃, PH7.5） 90mM Tris?Cl 50mM NaCl 10M MgCl2 10×buffer M（37℃, PH7.5） 6mM Tris?Cl 100mM NaCl 6M MgCl2 1mM DTT 10×BSA： 1mg/ml 无菌水 方法和步骤 1. 反应体系配制： 质粒pCDNA3－p38 10 μl（1μg） 10×buffer M 2 μl 10×BSA 2 μl EcoRⅠ 1 μl XbaⅠ 1 μl H2O 4 μl ————————————————— 总体积 20 μl 2. 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心收集液体。 3. Eppendorf管于37℃水浴中反应1.5小时。 4. 反应结束后70℃灭活15min或者加入EDTA至终浓度10mM终止反应。 5. 取20μl反应液加入6×loading buffer混匀于1.2％琼脂糖凝胶胶上150伏电泳，约30min。 加入5μl未酶切对照。 6. 凝胶成像体系观察记录结果。 7.当DNA条带充分分开后，在紫外灯下细心切取所要的DNA条带。尽量去除多余的凝胶。紫外灯照射DNA片段不要超过30秒。注意保护眼睛免受紫外线伤害。 实验结果 双链DNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数×50/1000。 RNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数×40/1000。 （在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 μg /ml。） 凝胶成像结果 1.2% Agarose Gel 1 2 3 4 1.1000bp DNA ladder 2. CDNA3-p38/EcoRI+XbaI 3. ppCDNA3-p38 4.100bp DNA ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel II 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel III 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel IV 思考题 1.要得到高质量质粒样品，用碱变性法小量提取质粒时要注意什么事项？ 2.溶液I、溶液II和溶液III的