HIV不同病程分子生物学检测.docx

HIV不同病程分子生物学检测及结果解读 1310115117 刘航齐 一、HIV核酸检测 HIV核酸检测有定性和定量两类,前者用于HIV感染的辅助诊断,后者常用于监测HIV感染者病程进展和抗病毒治疗效果。 1. PCR检测法(多聚酶链反应) PCR就是利用DNA聚合酶复制DNA的特性,把生物体内的 半保留增殖DNA的过程在体外实验条件下完成。传统的PCR技术比较简便、快捷,但是容易导致“污染”,出现假阳性结果 . 另外,HIV基因多样性,没有一套引物可覆盖所有HIV序列,使检测敏感性受到限制。从而限制了PCR临床诊断HIV。 不同病株存在遗传变异性，进行PCR扩增时应选择病毒基因组中的高度保守序列区设计引物。当核酸检测阳性，应重复采集样品进行复测，复测结果呈核酸阳性反应则判断为核酸阳性，复测结果为核酸阴性反应则判为不确定结果，需进一步随访检测。HIV核酸检测阴性，只报告本次试验结果阴性。 2. 刷状DNA检测法 刷状DNA检测法是定量检测血浆中HIV-1型RNA的一种方法。该技术基于分支DNA信号扩大系 统,是人工合成的带有侧链DNA片段,在每条链上都可以标记可被激活的标记物。通过发光强度来定量,发光强度与HIV-RNA含量呈比例。 3. 核酸序列扩增系统 核酸序列扩增系统又称自主序列复制系列或再生长序列复制技术,是以RT-PCR为基础,但它无需将逆转录和PCR扩增分作两部进行，将靶核酸RT-DNA扩增和信号放大扩增。 4. 基因芯片技术 基因芯片技术是 20 世纪 90 年代末发展起来的新技术,是在厘米见方的固相载体上,将基因以微点阵的形式排列,应用核酸杂交的原理来检测未知基因,具有操作简单、自动化程度高、 检测靶分子种类多、成本低、结果客观性强等特点基因表达、肿瘤诊断、遗传病诊断、基因分型等诸多领域得到广泛应用。 对于抗 HIV逆转录酶和蛋白酶药物的耐药性分析、型检测结果较好,但对非B亚型的耐药性检测存在漏检和错检。 二、HIIV抗体的确证 目前我国HIV抗体确证实验采用的方法是免疫印迹法，也就是westen blotting实验，简称WB。WB实验结果有3种，阴性，阳性，和不确定。对于不确定结果每3个月随访1次，共2次，仍属可疑，则报告阴性；如随访期间HIV抗体出现阳性反应则报告阳性。虽然抗体确证不属于分子生物学检验，但由于它在临床中经常应用，因此列举出来。下面是HIV抗体筛查流程。 三、分型 在HIV-1型内，根据env基因和gag基因序列的同源性差异可分为三个组：M组、O组和N组。M组内又分为A~K11个亚型，各亚型的基因离散率是25％~35％、同一亚型内的基因离散率是7％~20％。不同亚型可发生重组形成很多流行重组型。 目前HIV分型的方法主要集中在env、gag和pol区的某一段基因片段的分析。常用的方法有：SBT法、异源双链核酸涌动实验(HMA)、DNA酶联免疫技术、基因芯片法、多重PCR法。 HMA：在HIV分型检测中，利用PCR扩增evn或者gag一段核酸序列，同时将各亚型的标准质粒进行扩增，将病毒扩增产物和质粒扩增产物进行混合，经过变性和复性形成异源双链产物，然后进行电泳，根据涌动速度确定亚型。 DEIA：该方法是将特异性DNA探针固定在酶标板上，用病毒基因的扩增产物与探针进行杂交，产物与探针形成杂交链，结合抗DNA双链单克隆抗体后通过酶标二抗进行显色，从而确定待测样品的亚型。 多重PCR：利用多重PCR进行HIV亚型分析可以直接区别多种亚型。近年来，已针对gag、gp41基因区的亚型特异性引物用于多重PCR进行HIV基因分型，尤其是针对不同流行区的优势流行株设计具有针对性的多种PCR引物，直接通过电泳进行亚种鉴别，不失为一种简便易行的方法。 四、病毒载量的分子生物学检测 病毒载量测定是对感染者或病人体内游离病毒核酸RNA含量的定量测定。通常使用血浆作为检测样品,根据不同要求改进的RNA提取技术使该试验也可使用多种体液和组织。目前使用的病毒载量测定技术主要有3种:RT-PCR、 分支DNA信号扩大系统和核酸序列扩增系统。三种技术均由核酸提取、扩增或信号放大、定量检测四部分组成。 五、基因型耐药性的分子生物学检测 目前，HIV-1耐药性基因型检测主要是鉴定病毒基因组的特定区域是否存在与特定抗反转录病毒药物的易感性降低相关的特定突变。 耐药性基因型检测方法种类很多，各类方法主要集中在耐药性突变位点的检测能力和耐药性突变位点的评价能力上。耐药性突变位点检测即指得到序列信息，目前采用的方法主要是序列测定和杂交法等。