基因工程原理-第3章基因克隆载体.pptVIP

基因工程原理 Principle of Gene Engineering 第三章 基因克隆载体 针对受体细胞的可转移性 自主复制功能：ori 显著的筛选标记：抗药性或显色 特定的多克隆位点：RE位点 安全性：不含对受体有害基因、不任意转入其它细胞尤其是人体细胞 一、细菌质粒载体 ——宿主细胞染色体外裸露的双链DNA分子。 2. 质粒DNA分子大小 3. 质粒的复制 质粒DNA复制：单向复制，受宿主细胞和质粒遗传系统双重控制，不会无限制复制。 ——在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象叫质粒不亲和性。 接合型质粒：含有tra基因的质粒。F质粒 非接合型质粒：不含tra基因的质粒。ColE1 显性质粒：能使宿主细胞表现出质粒所携带的性状。 如： 隐蔽质粒：不会赋予宿主细胞新性状的质粒为隐性质粒。 （二） 构建质粒克隆载体的策略 （三） 质粒载体的构建 选择合适的出发质粒：ori，选择标记、克隆位点、启动子、终止子…… 正确获得构建质粒载体的元件 组装合适的选择标记基因 选用合适的启动子 构建过程简单 pBR322质粒的结构特征： 大小：4363bp 具有ColE1拷贝复制子 选择标记：Amp，Tet 24种限制性核酸内切酶单一位点 BamHI等导致Tet插入失活 PstI等导致Amp插入失活 可以克隆10kb以下外源DNA片段 ① pUC质粒载体的结构特点 pBR322的复制起点 Amp标记 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因LacZ的启动子、调节因子及编码α-肽链的DNA序列——LacZ’ 在LacZ’的5‘端有1段多克隆位点（MCS）区段。 相关概念： 溶菌生命周期：噬菌体吸附到寄主细胞表面后，注入DNA进行复制及蛋白质合成，并组装成子代噬菌体颗粒后，使寄主细胞破裂，释放出来的过程。 溶原生命周期：在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体上，随着染色体的复制而复制的过程。 温和噬菌体：能进入溶原周期和溶菌周期的噬菌体。 烈性噬菌体：具有溶菌生命周期的噬菌体。 溶原性细菌：带有温和噬菌体的细菌。 λDNA分子体外包装系统的建立 4.λ噬菌体DNA的包装限制问题 包装能力： λDNA×75%——λDNA ×105%， 即从36kb——51kb 野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为51kb-28kb=23kb。实际为15kb。 若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。 转染作用（transfection）：寄主细胞捕获噬菌体DNA 的过程。或重组噬菌体DNA分子感染并进入大肠杆菌的过程。 转导作用（transduction）：以噬菌体颗粒为媒介转移遗传物质的过程。 转化作用（transformation）：将质粒等外源DNA引入细胞的过程。 Ti质粒（Tumor inducing plasmid）——存在于植物的土壤致癌农杆菌中，诱发植物产生冠瘿瘤的质粒。 分为4种类型： Ti质粒是根癌农杆菌染色体以外的遗传物质 双链闭合环型DNA 200-250kb 结构分为4个功能区： 2. YEp24（酵母游离型质粒）载体 出发质粒：酵母2mm质粒和pBR322 ura3基因：尿嘧啶合成缺陷型基因 酵母V号染色体上的一个基因，系统命名号为YEL021W，编码乳清苷5-磷酸脱羧酶，是酵母RNA嘧啶核苷酸合成过程中关键酶。 应用方式： （2）阴性选择：乳清苷5-磷酸脱羧酶正常 （1）阳性选择：乳清苷5-磷酸脱羧酶缺陷 转入ura3基因，培养基中加入尿苷或尿嘧啶，缺陷株生长。 5-氟乳清酸 5-氟尿嘧啶， 乳清苷5-磷酸脱羧酶 细胞死亡 一、农杆菌Ti质粒载体 章鱼碱型 胭脂碱型 琥珀碱型 农杆碱型 第四节 植物基因克隆载体 （一）农杆菌Ti质粒 （Vir 区） （Con区） T-DNA区 Vir区 Con区 Ori区 第七次课结束！ 4. TA载体 T T A A 5. 质粒表达载体 ——表达载体是在克隆载体的基础上增加了表达元件构建而成的，在受体细胞内能稳定维持并表达外源目的基因。 lac启动子表达系统 质粒表达载体 融合型表达载体 非融合型表达载体 分泌型表达载体 融合蛋白质克隆载体克隆外源基因示意图 融合蛋白表达载体： 融合蛋白：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因转移产生的单一的多肽序列。 表达融合体蛋白质策略的优点： （1）克隆的外源基因能有效转译。 （2）表达的蛋白质稳定。 （3）可以加入信号肽，定位输送蛋白质。 （4）利于分离纯化。 非