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THANK YOU FOR YOUR ATTENTION 人有了知识,就会具备各种分析能力, 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书,广泛阅读, 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍,我们能丰富知识, 培养逻辑思维能力; 通过阅读文学作品,我们能提高文学鉴赏水平, 培养文学情趣; 通过阅读报刊,我们能增长见识,扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操, 给我们巨大的精神力量, 鼓舞我们前进。 * * PCR反应条件优化 反应温度(变性、退火、延伸) 反应时间(变性、退火、延伸) 循环次数(PCR效率及产物量) 1、温度 变性温度:94-97 ℃ 退火温度:低于引物Tm 5 ℃左右,一般55-60℃ 温度过高:降低扩增效率; 温度过低:增加非特异性扩增 延伸温度:72 ℃,此时Taq酶具有较高的酶促活性 2、时间 第一次变性应给予足够时间(5-7分钟) 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度,一般为 复性时间:30~60sec 延伸时间:1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min 3-4Kb的DNA片段,延伸时间3-4min 10Kb的DNA片段,延伸时间15min 3、循环次数 重复次数一般设为25~35个循环 扩增反应的平台效应: 理论上,PCR反应产物呈指数性增长,但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止,达到反应平台,此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长 PCR反应曲线 PCR 产物分析Analysis of PCR products Gel analysis (琼脂糖凝胶电泳/聚丙烯酰胺凝胶电泳 ) : PCR 产物电泳,EB(溴乙锭)染色, 紫外仪下观察,初步判断产物的特异性。 Restriction-endonuclease digestion analysis: 酶切、电泳分离。 产物的鉴定,基因分型,研究变异性。 Hybridization : (Southern blot/dot blot ) electrophoresis/hybridization Sequence analysis:是检测PCR产物特异性的 最可靠方法。 常用PCR技术 原位PCR (in situ PCR) 多重PCR(multiplex PCR) 长距离PCR (Long-range PCR) 逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR) 荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR) 巢式PCR(nesting PCR)-4条引物 原位PCR (In situ PCR) 原位聚合酶链式反应(In situ PCR)是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 原位PCR的作用 利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。 多重PCR(Multiplex PCR 复合PCR) 用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电泳 引物 1 2 3 4 1 2 3 4 RT-PCR(reverse transcription-PCR) Temin,H.发现反转录酶, 1975诺贝尔奖 技术关键: 利用逆转录酶,把mRNA反转录成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。 RNA template 3’ 5’ 下游引物 cDNA first strand 3’ 5’ 上游引物 cDNA first strand cDNA second strand 3’ 5’ 3’ 5’ 反转录酶 Taq酶 PCR Reverse transcription (RT) 下游引物 上游引物 Taq酶 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)限制性 片段长度多态性 1. 分析已知突变 。 2. 突变碱基涉及酶切位点的变化。 PCR---- 酶切------ 电泳 PCR-RFLP 5’ CCACGG 3’ 3’ GGTGCC 5’ * 5’ CCATGG 3’ 3’ GGTACC 5’ * Resistance to NcoI Digesti
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