重医大2011级硕士研究生蛋白质组学试题附答案.docVIP

重庆医科大学 2011级硕士研究生《蛋白质组学》试题 姓名 魏俊 学号：2011120028 所在大班：蛋白质组学5班 专业： 在职医学影像 一、解释（共15分） 1、MALDI TOF MS（10分）答：即基质辅助激光解析离子化/飞行时间质谱，为近年来快速发展的一种新型软电离生物质谱，该仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。 基质辅助激光解吸离子化是利用一定波长的激光脉冲，在极短的时间间隔，对含被测样品靶物的一个微小区域提供高能量，从固相直接获得离子的电离方法。该方法特别适用于对热敏感化合物或不挥发化合物的离子化。 飞行时间质量分析器的离子分离是用非磁方式达到，离子在离子源中形成后被电场加速，进入真空无场漂移区，具有不同质荷比的离子因其通过漂移区的时间不同而实现分离。先后到达检测器产生信号。 按照仪器构造不同，又可分为线性飞行时间质量分析器和反射飞行时间分析器。基质辅助激光解吸离子化/飞行时间质谱谱图中的主要信号是完整的分子离子峰，因此单电荷分子离子峰占主要地位，随着分析量增加，双电荷离子相对丰度增加，并出现多电荷离子。 MALDI-TOF-MS的中心技术：依据样品的质荷比（m/z）的不同来进行检测，并测得样品分子的分子量。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点。近年来已成为生命科学领域蛋白质组研究中必不可缺的重要关键技术之一，用于检测和坚定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、高聚物以及多种合成聚合物的强有力的工具。 2、免疫共沉淀（5分） Co-Immunoprecipitation（Co-IP），是以抗体-抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能被沉淀下来。该技术可用于鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合以及进行结合位点分析，还可用来筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。 二、 问答题（共85分） 1、Western Blotting 的流程（10分）。 Western Blotting实验流程 第一步：蛋白样品制备 ????????蛋白抽提质量的好坏直接决定着Western结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。作为沃尔森的优势产品，我们为您提供RIPA改良型试剂盒以提取细胞或组织的总蛋白。 ??????? RIPA改良型试剂盒（WB0001，WB0002）中提供蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、裂解缓冲液Lysis Buffer、PMSF等，可在非变性条件下从哺乳动物组织和培养细胞中提取总蛋白，获得的总蛋白可用于Western Blotting、免疫共沉淀等后续研究。 ? 第二步：蛋白定量 ????????为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。如使用沃尔森公司生产的RIPA改良型试剂盒，建议您使用 BCA法测定蛋白浓度（WB0003，WB0004）。 ? 第三步：电泳 (1) SDS凝胶配制 ??????? 沃尔森的 SDS凝胶配制试剂盒（WB0006）提供了所需的试剂以及配制各种浓度SDS的配方，我们也为您提供了制胶所需的各种组分： 30% Acr-Bis(29:1)（WB0014）；? 40% Acr-Bis(39:1)（WB0015）；? PMSF(100mM)（WB0016）?； 0.5M Tris-HCl,pH6.8（WB0017）；? 1.5M Tris-HCl,pH8.8（W0018）。? (2) 样品处理 ??????? 每80μL样品加入20μL的 5×SDS蛋白上样缓冲液（WB0005），混匀。置于100℃的水浴加热10min，14000g离心20min，取上清液进行电泳。 (3) 上样与电泳 ? 第四步：转膜 ??????? 转膜缓冲液可以参考《分子克隆》自行配制。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 ??????? 转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。也可以用沃尔森的 丽春红染色液（WB0008，WB0009）对膜进行染色，以观察实际的转膜效果，并用铅笔在膜上做出适当标记。还可以用沃尔森的蛋白质 考马斯亮蓝染色检测