111116一站式gst标记蛋白质微量纯化套装使用手册v1点0.docVIP

蛋白质研究 CAT#：111116A CAT#：111116B-20 常温运输和保存，溶菌酶、Benzonase和PMSF需要低温运输，-20℃ 一站式GST标记蛋白质微量纯化套装 one-Stop GST-Tagged Protein Miniprep Pack 使用手册V1.0 北京天恩泽基因科技有限公司 北京市海淀区学院南路12号北师大留学生创业园57号楼301室 QQ:944823743，449730601（销售），948393554（技术）， 电话： 010010销售）技术），order@ 原理及特点 重组蛋白N端的GST谷胱甘肽S转移酶（Glutathione S Transferase）能提高重组蛋白的水溶性，所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用GST标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合，并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立，是目前分离纯化GST标记蛋白质的重要方法。本产品就是专门用于上述目的，具有下列特点： 一站式套装，含所需的谷胱甘肽介质、溶液和层析柱，用户只需要提供表达GST标记蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。 专一性强，一次过柱即可获得纯度高达95%的GST-标记蛋白。 只能在非变性条件下使用，只可用于纯化没形成包涵体的GST标记蛋白。 每次可以处理20 mL的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。 提供2 mL 谷胱甘肽-Agarose介质，可吸附5-10 mg GST标记蛋白质。 本介质可以反复使用多次。 规格及成分 成份 20次小盒包装A型 （111116 20次小盒包装B型 （111116B-20） 谷胱甘肽-Agarose介质 2 mL 2 mL 10×PBS缓冲液 （CAT#:100215-100） 100 mL 100 mL 溶液A 1 mL 无 GST洗脱缓冲液成分一 25 mL 25 mL GST洗脱缓冲液成分二 约80 mg 约80 mg 溶菌酶（20 KU/mg） 无 30 mg Benzonase（2U/uL） 无 20 uL PMSF（10 mg/mL） 0.5 mL 0.5 mL 6 mL层析柱(带筛板) 1套 1套 使用手册 1份 1份 运输及保存 常温运输和保存，溶菌酶、Benzonase和PMSF需低温运输。收到货后，介质需4℃保存，溶菌酶、Benzonase和PMSF需-20℃保存， 自备试剂 超纯水 使用方法 注意： 每步得到的样品最好都留存少量作为SDS分析的对照，在下面描述中就不再提醒。 本实验需要用到的1×PBS缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供的10×PBS缓冲液而得。PBS缓冲液用超纯水稀释后极其容易长细菌，注意防止污染。 GST洗脱液的配制方法是将约80mg GST洗脱液成分二全部加入到GST洗脱液成分二中，摇晃直到干粉全部溶解即得GST洗脱液，分装成小份放-20℃保存，每次用一管 一:重组蛋白的表达和细菌收集 37℃振荡培养2 加IPTG到终浓度为0.1 mM，30℃振荡培养3小时或22℃振荡培养8 4℃ 5000 g离心10分钟收集20 mL表达菌液 用1×PBS缓冲液重悬细菌沉淀，4℃ 5000 g离心10分钟，弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80 二：细胞裂解 如果用本产品A型，用1 mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液（1 mL 1×PBS缓冲液+50 uL溶液A+ 25 uL 10 mg/mL的PMSF溶液）重悬细菌沉淀，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，一般选1K-10K频率处理15次，每次20秒，间隔1分钟（必需放置在冰上）。裂解物不能粘稠，否则会堵塞层析柱。 如果用本产品B型，用1 mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液和25 uL 10 mg/mL的的PMSF溶液以及1 uL Benzonase，重悬细菌沉淀，重悬后再加入，冰上放置30分钟。细胞裂解液配制方法是将25 mL 1×PBS缓冲液和30 mg溶菌酶干粉混合，溶解后分装成1 mL/管，没用的部分放-20℃保存 将超声或酶法细胞裂解物在13000 g 4℃离心10分钟去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱 三：层析柱的制备和GST蛋白纯化 摇晃将谷胱甘肽-Agarose介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质用量需要根据GST蛋白产量决定，100 mL菌液一般使用200 uL介质即可）。下列步骤各溶液的用量均针对200 uL介质而定，如果介质用量不同，各溶液用量需相应调整。 用5 mL 预冷的1×PBS缓冲液洗柱。 将第7步得到的上清液（含可溶性GST标记蛋白）上柱，让重力使上柱液自然流出，收集并保存穿透液用于SDS电泳。GS