肿瘤的病理诊断基础4.pptVIP

流式细胞分析术（ flow cytometry , FCM ） 原理 ：将悬浮在液体中分散的细胞微粒一个一个地依次通过检测区，细胞流速可达9m/s,当细胞通过微孔与激光呈垂直交汇时就可产生相应的电脉信号，这些代表着多种荧光强度参数的电信号再经过计算机处理，得出相应的供分析使用的点图、直方图和三维结构图。 DNA定量检测技术及其应用 癌前病变的DNA倍体分析：异倍体的出现是癌变的一个重要标志，应用流式细胞分析癌前病变及不典型增生细胞的DNA含量，可协助诊断和鉴别不典型增生和早期癌;实体肿瘤DNA分析与预后的关系 . 细胞凋亡检测术：目前检测凋亡常用的方法是DNA断点的TUNEL和ISNT法，标记DNA断裂的3-羟基末端，可用直接或间接标记法 3.癌基因定量技术：测定细胞Cyclin ( 周期蛋白 ) 对细胞周期起重要的调节作用，使用流式细胞仪测定CyclinA、B、E、D等以了解这些蛋白在细胞周期活动中的变化及作用。此外还可检测有些抑制细胞分裂作用的细胞周期蛋白，如P21、P16、P18、P27等，他们在细胞周期中也起着很重要的调节作用。多药耐药基因（multi-drug resistant gene,MDR）的表达产物P-170能将抗癌药物排出细胞外，通过流式细胞仪检测可以指导临床用药。 分子病理学技术在病理诊断和预后中的应用 ㈠．原位杂交（In situ hybridization ,ISH）：是一种将分子杂交与组织化学相结合的一项技术，它用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。 ㈡．PCR技术： PCR是一种体外试管内成百倍地特异性扩增某一DNA片段，其长度一般小于1Kb。在加热后使DNA双链解链之后，用降温的方法使两条单链按碱基互补原理分别与加入的一对人工合成的寡核苷酸链引物结合。在耐热的DNA聚合酶作用下反应体系中的游离单核苷酸，在引物的引导下，以单链DNA为模板，按3ˊ－5ˊ端方向，合成出两条新的与模板DNA互补的子链。重复上述过程，可以使模板DNA以2 n的方式扩增（n为循环次数）。 (三）原位PCR (in situ PCR )技术 实验材料：（1）悬浮细胞；（2）涂片细胞；（3）组织切片。 1．直接法原位PCR ( direct in situ PCR ): 特点是使阔增产物直接携带标记分子。操作简便，特异性较差，容易出现假阳性结果，且扩增效率较低。 2．间接法原位PCR ( indirect in situ PCR )：主要步骤：标本固定，目的是保持原有组织细胞的形态结构；渗入，即让引物﹑核苷酸和酶等反应液进入细胞内；原位扩增；原位杂交检测，用特异性的标记探针对扩增产物进行原位杂交，然后再根据标记分子的性质用亲和组织化学方法或免疫组织化学方法显示其扩增信号。 原位杂交、PCR、原位PCR的应用： 1．检测内源性基因 ⑴ 固有基因:机体细胞基因形态学上了解很少，原位PCR的问世，对基因的定位检测提供了最敏感﹑最有效得手段。 ⑵ 异常或变异基因 ：基因突变都可以用原位PCR来进行检测和研究。 2. 检测外源性基因 ⑴ 感染基因：病毒基因——现在原位PCR正广泛用于HBV﹑HIV﹑HPV﹑HSV等病毒性疾病的诊断及相关肿瘤的诊断及研究。细菌基因——用于某些细菌感染性疾病，如结核病及麻风病的诊断。 ⑵ 导入基因：转基因细胞，转基因动物或接受基因治疗的患者，都可以用基因检测的手段对外来基因进行鉴别，并判断基因导入新环境后发生那些突变等。 生物芯片 1. 基因芯片 2.蛋白芯片 3.组织芯片 图像分析技术在肿瘤病理诊断与研究中的应用 病理诊断和研究一般以定性或半定量描述为主，缺乏精确﹑客观的量化指标，不同观察者之间，存在一定的主观性及误差，应用多媒体图像分析技术进行形态测量分析，使形态量化，一定程度上解决了这个问题。 图像细胞术（imagecytometry ICM）,将二维平面的图形结构要素量化并进行分析则； 体视学（stereology ）。是由二维图形结构信息通过数学统计公式的计算来推论三维结构信息的分析法 在肿瘤诊断与研究中，图像细胞术主要测量三个方面的参数。即测量平面形态参数的ICM；测量光密度的DNA含量分析；测量呈色反应产物（包括细胞化学﹑免疫组织化学及原位杂交）的ICM.。 ㈠．图像（形态定量）分析技术 1．良﹑恶性肿瘤的区别上的应用 2．肿瘤的病理分级上的应用 3．参数与肿瘤预后的评价㈡．图像细胞光度技术 （二）细胞核DNA倍体状态的图像分析：测量DNA 含量可作为诊断癌细胞的客观依据。具有正常DNA含量的细胞称二倍体（diploid）,而恶性细胞由于其DNA含量与正常不同则称为非整倍体或异倍体（ane