SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳.docVIP

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验目的:测定蛋白质亚基的分子量及纯度 实验原理：在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率和分子量的对数呈线性关系，可以用来测定蛋白质亚基的分子量。 基本过程：制胶、电泳、检测 试剂：（储液由专业人员配置）30%丙烯酰胺单体储液、10%过硫酸铵、TEMED、1.5mol/L Tris-HCl, pH8.8、1.0mol/L Tris-HCl, pH6.8、10%SDS、10XTris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、2Xloading buffer、水饱和正丁醇 器材：灌胶支架、玻璃板、梳子、电源、加热器、电泳槽、扫描仪 实验操作程序： 安装灌胶模具，依照说明书进行 按照配方配置一定量（7cm模具配置1mm厚的胶配置5ml）的分离胶溶液和浓缩胶溶液（2ml），过硫酸铵和TEMED在用前加入。 分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具，上方留约1.5-2cm用于加浓缩胶，小心的在分离胶的表面加一层水饱和正丁醇（或水饱和的异丙醇、水），封住胶面，以促使聚合并保持胶面平整。 室温放置40分钟到1小时后，可以看到一个界面，去掉上层覆盖液，用浓缩胶缓冲液淋洗胶面，然后灌制浓缩胶，并插入和模具大小相同，凝胶厚度相当的梳子。 静止放置40-60分钟使凝胶聚合，电泳液清洗样品孔。 制备好的蛋白质样品用2Xloading buffer 1：1混合，和分子量marker 一起100℃煮3-5min, 12000rpm离心5-10min，（7cm模具、1mm厚度、10孔、考染上样量30ug） 加入下槽液，把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽，加入上槽液，上样。 连接电源，5-10mA/胶开始电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶后加大电流到10-15mA/胶， 溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳，取出凝胶，做好标记，准备染色。 染色。见考马斯亮蓝染色操作规程及银染色操作规程。 扫描。扫描操作见扫描仪的使用说明。 注意事项 在加过硫酸铵和TEMED之前溶液最好抽气，防止溶解在溶液里的分子氧在聚合时产生气泡使胶不均一。 过硫酸铵和TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。 分离胶聚合后最好在4℃放置12小时后再使用，以使凝胶充分聚合，改善电泳时的分辨率。 为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。 如果带着梳子过夜可能会影响分辨率，所以浓缩胶最好在使用前再灌制。 如果没有足够数目的样品，应在加样孔中加样品缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近的带扩展。 对样品浓度不确定的情况下，加样时使用梯度加样法，能大致估计出样品的浓度。 参考文献： 1．《蛋白质电泳实验技术》郭尧君编著 固相pH梯度-SDS双向凝胶电泳实验操作程序 实验目的：分离蛋白质混合物，将样品进行电泳后，为了不同目的在它的直角方向再进行一次电泳。常说的双向电泳是根据蛋白质所带的电荷和分子大小对蛋白质混合物进行分离。 实验原理：第一向等电聚焦的基本原理是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。第二向运用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳根据分子量大小对蛋白质进行分离。 基本过程：等电聚焦、平衡及转移到二向、SDS 试剂或储液：IPG buffer、矿物油、DTT、碘代乙酰胺、过硫酸铵、TEMED、1M DTT、rehydration buffer、平衡液储液、30%丙烯酰胺单体储液、1.5M Tris-HCl、10% SDS、10X Tris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、0.5%琼脂糖、水饱和正丁醇、占位液 实验操作程序： 等点聚焦部分 根据选用的胶条的长度计算上样体积（见附1），加1M DTT到终浓度50mM需要的体积，补加IPG buffer到终浓度0.2%或者0.5%的体积，加rehydration buffer到该胶条的上样体积。 把各种溶液按计算的体积加入到eppendorf管中，充分混匀，（或者超声5-10min）14000rpm,10℃离心5min。 取出胶条室温放置10min，平衡胶条的温度。 沿着聚焦盘中槽的边缘从左至右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+，安玛西亚胶条为尖端）对应于聚焦盘的正极（安玛西亚为尖端）。确保胶条和电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气