流式细胞术培训.pptVIP

这是一个非常简单的统计，也能反映出流式细胞仪的使用是在高速增长，近来几乎每十年相关文章就增加一倍。我2004年来所的时候，做流式实验的还非常上，06年07年开始流式试验越来越多，增加得非常快。事实上生物学研究当中，流式细胞仪已被应用到细胞功能研究的所有方面，已经成为一种必不可少的有力工具。有人说：“做细胞的就没有不做流式的”。 那么，这是今天要讲的主要内容，包括流式细胞仪的原理，功能特点，样本制作的原则等等。 流式细胞仪应用非常广泛，那么为什么它会这么有用 我们可以将流式细胞仪想象成荧光显微镜，只是以上这三个方面与所不同而已。就是让细胞流动起来，用PMT代替人眼和CCD来检测细胞中颜色的荧光而已。因为细胞是一个一个的检测，所以流式是一种单细胞荧光定量的仪器。下面将的原理部分，主要也就是介绍如何让细胞动起来，如何把不同颜色的荧光分开进行检测。 除了我们生物学研究，它还有这些应用。这是几个著名的应用。事实上，流式是检测HIV的标准方法之一。器官移植当中，通过交叉配型预先检测异体排斥反应。早期人类基因组计划，就是通过流式分选单条染色体以进行测序，由此获得DNA侧序必不可少的最初始的信息。商业上，在奶牛场，赛马场等，通过分选精子，控制后代的性别。利用流式细胞仪多参数测量，把由干细胞分化而来的各个层次的细胞区分出来。还有就是，在很多科考船，都装有流式细胞仪，进行海洋环境微生物研究。 对于流式细胞仪的这些功能特点，在介绍完工作原理以后，大家就会对它有一个更具体的认识和感受了。 目前流式细胞仪可以测量的颗粒的大小，最小也就在最小的微生物的尺度（支原体衣原体）。需要注意的是，并不是所有的流式细胞仪都能达到这个水平，很多适合测量动物细胞的流式并不太适合测量微生物，现在也有专门用于微生物测量的流式细胞仪（APOGEE）。 这一部分内容比较重要。我简单的把流式细胞仪能够测量的细胞指标分成这样的三来：细胞膜，细胞质和细胞核。 细胞膜上的，包括各种膜结合的成分，如表面抗原，受体，离子通道等等，以及膜本身的参数，包括膜的成分，流动性，通透性，膜电位等等。细胞质中呢，主要包括各种已经开发出相应抗体，可以进行免疫荧光染色的蛋白质分子（这个是非常多的），还可以测蛋白磷酸化，甲级化，乙酰化等修饰。另外，各类能被特异性染色的细胞起，以及胞内无极离子等。 核酸分析又是非常大的一类，包括DNA，RNA含量，结构，单双链，端粒等。 另外就是不需要荧光染色就能测量到的一些细胞参数。 这张表格，列出了一些可检测的细胞指标以及相应的染料或检测方法。就不多讲了。 总之，可以检测的参数非常多。流式的多参数测量能力，允许我们将不同的参数组合起来。这就有非常大的灵活性。 可以巧妙的设计精彩的实验。这里我们也能看出，荧光染色技术对流式的应用是极为重要的，开发新的染料往往就能带来新的应用或者原有应用的改进完善。而现在，流式细胞仪的新应用，也是在高速增长的。 流体动力学聚集就是实现让细胞流动并排着队依次检测的原理。流动室（又叫喷嘴），是它最重要的部分，也是其命名的由来。但其实非常简单，一般的喷嘴就是一个顶端开口的圆柱锥型结构。 因为最终出口液流的速度非常快，所以流式检测速度可以到20万个细胞每秒！（它的这个高通量特性对人工进化的筛选非常有利）。 这个实验非常直观的说明流体动力学聚集的原理。这是液体中的一段玻璃管，在稳定的压力下液体进入到管中。在玻璃管外引人墨水，就看到墨水会聚集成一条线在玻璃管里流动，不会发送扩散和周围液体相混，并且进入玻璃管以后流速就恒定了，当然在进入玻璃管的聚焦过程中流速是逐渐加快的。（也就是垂直方向上流速为0）。所以在流式细胞仪当中，细胞都是排成一条线沿同一个轨道高速流动的。 激光的轴线和前向透镜的轴线是重合的，它们与液流的轴线垂直，并且激光焦点的中心定位在液流轴线上。测向透镜的轴线与这个平面垂直并与之相交于同一个点，这个点也是侧向透镜的焦点。我们知道细胞流动的轨道是非常精确稳定的。所以，流式测量可以实现非常高的精确性（一般的流式荧光强度相差2%的两个细胞就可以区分开）。能量集中，也使得仪器的灵敏度得到提高。 有多干激光激发的时候，各个激光的焦点就一次排列在液柱上。不同激光激发的荧光信号，尽管波长一样，但是也不会相互干扰，能被区分开。（因为空间位置不一样）。 下面介绍细胞通过探测点产生信号的过程。 首先是散射光信号的产生。激光照射在细胞上的时候，一部分光会被散射。前向为小角度散射（0-2度范围），细胞越大被散射的光就越多。一些可以检测小颗粒的仪器会收集更大角度的信号。侧向散射是由于细胞表面的不规则，细胞内部的一些膜结构颗粒等，向各个方向反射激光信号。所以，如果细胞内这种颗粒越多，细胞形状越不规则，被随反射到侧向的激光就越多（SSC越强） 荧光的产生。实际上细胞