噬菌体7--（精选）公开课件.pptVIP

基因克隆载体(λ噬菌体载体) 噬菌体(bacteriophage)：是感染细菌、真菌、 放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、 微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。 头部 核心：核酸（DNA或RNA） 衣壳：蛋白质，六边形立体对称 尾部( 蛋白质) 尾髓、尾鞘、尾板、尾丝、尾刺 与吸附宿主有关 蝌蚪形噬菌体结构模式图 种类 根据噬菌体与宿主菌的相互关系，噬菌体可分为两类 温和性病毒：病毒感染宿主后，其DNA与宿主染色体DNA整合，一起复制和传代，无感染其他细胞的能力。（溶源性增殖途径） 烈性病毒：其DNA不插入染色体DNA，经过一定时间的潜伏期，大量增殖新的病毒颗粒，使宿主破裂，释放的病毒又感染其他细胞。（溶菌性增殖途径） 噬菌体是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。 噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 λ噬菌体克隆载体 1、 λ噬菌体的一般生物学特性 线形双链DNA分子 长度约为48.5 kb 分三个区域： 左右臂和中段 cos位点 在λDNA分子两端各有12bp的单链5’互补粘性末端，且两者的核苷酸序列互补，当λ噬菌体进入细菌细胞后，其DNA可迅速通过粘性末端配对而成双链环状DNA分子，这种由粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点（cohesive end site） λ噬菌体的改造 设计去除λDNA上的多余序列和一些限制性酶切点：因为λDNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。 在中段非必需区，替换或插入某些标志基因，如可供蓝白筛选lacZ’序列和多克隆位点等。 建立重组λDNA分子的体外包装系统。 λ噬菌体载体的类型 插入型载体（insertion vectors ）：只具有一个限制酶位点，可便于外源DNA插入的称为插入型载体。常用的λgt系列载体，一般容许插入5-7kb外来DNA 。 置换型载体（replacement vector）：含有二个限制酶切点，在两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA片段所取代。 包装容量 λ噬菌体载体可插入长5-20kb的外来DNA，这比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。但λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。 理论上的极限值可达23kb，但事实上较为有效的克隆范围仅为15kb左右 λ噬菌体载体的应用 建立cDNA文库 cDNA与载体重组，或经体外包装成噬菌体颗粒后转导宿主细胞，或不经体外包装直接转染宿主细胞，但转导的效率较高 克隆外源目的序列 为了使外源基因能有效转录，将其插入λDNA的PL启动子或PR启动子的有效转录区内 λ噬菌体载体的克隆原理和步骤 （1）通过裂解过程增殖载体 通过噬菌体的增殖，从中提取噬菌体DNA 噬菌体载体均含有与裂解生长所必须的基因片断，不同的载体采用不同的大肠杆菌宿主菌来增殖。 经过裂解生长获得噬菌体颗粒，再经过分级分离分化，可用于提取噬菌体DNA。 （2） 载体与外源片断的酶切 插入型载体来说，载体被酶切后，很容易自身连接，一般对载体的进行去磷酸化。 置换型载体，切割后形成左臂、填充片断、右臂，填充片断的存在会影响连接效率，必须纯化左臂和右臂。 （3）外源片断与载体的连接 通过载体的粘性末端，将载体连接成多联体，以利于将两个cos位点之间的片断装入噬菌体颗粒 （4）重组噬菌体的体外包装，形成有感染力的噬菌体颗粒 利用特殊材料，制备噬菌体包装蛋白 连接产物与包装蛋白混合时，就可完成包装反应，形成有感染力的噬菌体颗粒 包装蛋白对所包装的DNA大小有高度选择性， 范围：λDNA分子的75％－105％ * 左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。 中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列 ，但非溶菌生长所必需，外源DNA的克隆部位。 右臂：长约10kb，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。 *