多酚氧化酶制备与性质.pptVIP

多酚氧化酶（PPO）的制备、鉴定、性质及应用 石松山 2010.11.20 outline 简介多酚氧化酶 实验部分 PPO粗酶制剂的制备 柱层析提纯 PPO的性质及应用 注意事项 简介 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，简称PPO） 氧化还原酶 金属蛋白酶 广义上，PPO可分为单酚氧化酶、双酚氧化酶、漆酶 马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PPO, 。 在PPO中，铜是酶的活性中心，从蛋白质中除去一部分或全部铜，将引起酶活性下降或完全失活，若添加铜的话，酶活又能恢复。不同果蔬中的PPO铜辅基的数量会有所不同，如蘑菇中PPO含4个铜原子，而扁豆的PPO含1个铜原子。 研究PPO的意义 现在PPO的应用多用于提高植物对病原菌的抗性。如，黄瓜对黑星病的抗性、水稻对白叶枯病的抗性等 PPO与一些水果和作物的褐化有关。PPO催化多酚氧化为醌，醌聚合并与细胞内大白纸的氨基酸反应，结果产生很色素沉淀。 PPO是决定红茶品质的关键酶类。在啤酒生产过中,PPO与啤酒风味陈化紧密相关。反之,为了防止水果褐化,保持水果新鲜,生产上也运用多种方法降低水果中PPO活性和含量。 实验部分 PPO的制备 1. 制备马铃薯丙酮粉 取50g去皮切丁的马铃薯 与60mL丙酮（-20℃）混合 粉碎 抽滤 滤渣用-20 ℃的丙酮冲洗至白色 室温下晾干。 2. PPO粗提液的制备 5g马铃薯干粉 与40mL粗酶提取液混合 搅拌1min 静止1hr，4℃ 离心（4℃，15000rpm，15min） 过滤取上清，即得PPO粗提液 粗酶提取液为4.2g+1000mL0.2M PB PPO纯化之盐析 盐析原理 PPO的纯化常采用盐析法。盐析主要是利用酶蛋白在高浓度的盐溶液中溶解度减小而析出的原理。硫酸按由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定，故是最常用的盐析剂。 2. 实验步骤 粗酶制剂加入等体积饱和(NH4)2SO4 静置1hr，4℃ 离心 （4℃，17000rpm，10min） 收集沉淀 加15mL0.2MPB溶解 再次离心（条件同前） 收集上清，即得PPO粗酶制剂 取4mL粗酶制剂于冷冻干燥机上冻干，得PPO干粉。 PPO纯化之柱层析 文献报道植物组织中PPO分子量一般介于40-70K之间，Sephdex(葡聚糖凝胶)具有分子筛效应，一定型号的具有一定的孔径。 柱子是不是愈长愈好？作用是什么？ 装柱和上样适应注意什么？ 层析系统 装柱 平衡 加样 洗脱 收集 分离原理 在用Sephadex进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液。 PPO性质（略，周四） PPO定性鉴别 PPO 化学性质 PPO底物专一性（邻苯二酚，对苯二酚，间苯二酚） 底物浓度 酶浓度 pH的影响(活性最强在6.8-7.2) 详见教材 PPO抑制剂及其应用 金属离子的影响（二价离子，Zn2+等） 二价铜离子及铜铁试剂的影响 某些有机溶剂的影响 其他抑制剂（NaSO3、Vc）的影响 苹果的保险实验 详见教材 注意事项 高速组织捣碎机的使用 先慢后快 干粉应抽滤至白色 PPO粗提液应接近无色 盐析时硫酸铵不宜过多或过少 PPO粗酶制剂定性鉴别前，先测活性。 0.01M邻苯二酚需现配，本次用量极少 （避免接触光照和空气） * * 化学生物学实验—— 植物 在植物组织中，PPO是与内囊体M膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后被活化，从而表现出活性。 恒流泵 部分收集器 梯度混合仪 层析柱