第五章酶细胞原生质体固定化.pptVIP

Chapter 5 酶、细胞、原生质体固定化与应用 Section 1 酶的固定化概述 二、什么是固定化酶 Section 2 固定化酶的制备与特性 一、固定化酶的制备方法 1．吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。 物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。 2．包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。 包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。 3．结合法 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。 根据酶与载体结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。 4．交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。 5．热处理法 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。 二、固定化酶的特性 1．稳定性： (1) 对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度； (2) 保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长时间； (3) 对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解； (4) 对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。 2．最适温度： 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有较明显的变化。例如，用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高5～10℃等。 3．最适PH值： 酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。 4．底物特异性： 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。 Section 3 微生物、植物和动物细胞固定化 一、细胞固定化的方法 1．吸附法 利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法。 用于细胞固定化的吸附剂主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。 2．包埋法 将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。 以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内而使细胞固定化的方法称为凝胶包埋法。细胞经包埋固定化后，被限制在凝胶的微孔内进行生长、繁殖和新陈代谢。 凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。 凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。 如：琼脂凝胶包埋法 将一定量的琼脂加到一定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至48～55℃，加入一定量的细胞悬浮液，迅速搅拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球状固定化细胞胶粒，分离后洗净备用。 二、固定化微生物细胞的特点 ① 固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好。 ② 固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。 ③ 发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间。例如，用海藻酸钙凝胶包埋法制备的黑曲霉细胞，用于生产糖化酶可以连续使用一个月。 ④ 固定化微生物细胞密度提高，可以提高产率。如海藻酸钙凝胶固定化黑曲霉细胞生产糖化酶，产率提高30%以上。用中空纤维固定化大肠杆菌生产β-酰胺酶，产率提高20倍。 ⑤提高工程菌的质粒稳定性。 三、植物细胞固定化 1．固定化植物细胞具有下列特点： ① 植物细胞经固定化后，由于有载体的保护作