蛋白质与酶工程 第三章 酶的分离纯化2016.ppt

凝胶电泳 1、聚丙烯酰胺凝胶（PAG） PAG由丙烯酰胺（ arc，单体）和甲叉双丙烯酰胺（ bis，双体，交联剂）在催化剂作用下聚合而成。 arc浓度：凝胶的孔径大小 arc和bis的比例：凝胶的强度 催化剂用量：聚合时间 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 2、PAGE的应用类型 常规PAGE 浓度梯度PAGE SDS不连续PAGE（用于一般分析分离纯化） 连续PAGE（同上） （用于测定Pr相对分子质量和分离纯化） （用于测定Pr单体相对分子质量和双向电泳） √ √ √ 3、不连续PAGE的特性和分离Pr的效应 （1）三个不连续 凝胶浓度不连续； pH值不连续； 缓冲液不连续。 （2）三种效应 浓缩效应； 电荷效应； 分子筛效应。 4、浓度梯度PAGE 配制4%和30%的分离胶，用梯度混合仪制成从上至下4%~30%的均匀浓度梯度凝胶，其网眼孔径从上至下越来越小，电泳时，不同Pr主要依 r 大小而分离，即分子筛效应电荷效应，可用于测定蛋白质的相对分子质量。 5、SDSSDS：十二烷基硫酸钠 CH3（CH2）11SO4Na2 在配制凝胶时加入SDS，同时加巯基乙醇，Pr在电泳时，其中的寡聚体Pr解聚为单体（亚基），SDS分子就将每个单体分子表面覆盖起来，使其形成短轴为1.8nm，而长轴各异的SDS—亚基复合物，电泳时，他们的表面电荷基本相同，故可因分子长轴大小（即亚基分子大小）差别而分离，换言之，亚基的大小是彼此分离的依据，所以此法可用于测定单体的相对分子质量。 6、PAGE的一般操作程序 配制各种制胶的贮存液 准备制胶模具 配制铸胶混合液 灌注胶液并聚合成凝胶 上槽 点样 通电电泳 取出凝胶 Pr染色 漂洗显带 记录计算 绘制电泳图谱 SDS测定蛋白质（亚基）的相对分子质量（Mr）与它们的电泳迁移率（U）之间，存在如下关系： lgMr = lgK - bU 用 lgMr 对 U 作图，只要实验测得，就可用标准曲线法求得未知蛋白质（亚基）的相对分子质量。 实际工作中，常用相对迁移率（用 mR 表示）代替 U 作图。 mR = 蛋白质移动的距离 溴酚蓝移动的距离 2.琼脂糖凝胶（Sepharose ；Bio-Gel) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度 越大，网状结构越密集。 3.Superdex 是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成 的。分辨率非常高，化学物理稳定性也很好 。 4.聚丙烯酰胺凝胶 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉 双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。 商品名为生物胶-P（Bio-Gel P)。 凝胶技术参数指标 凝胶型号：如SephadexG-10;G-25; 粒度范围：100-200mesh 床体积（ml/g）:每克干胶溶涨后的体积 有效分离范围：如1x103?1x107 工作pH: 4-12 最大流速：1 ml/min 最大承受压力: 2MPa 三、凝胶的选择和保存  1. 凝胶的选择 例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。 2. 凝胶的保存 凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02％的叠氮化钠, 或20%酒精,4?C下保存。 四、 凝胶过滤在试验室中的应用 1）生物大分子物质的分离纯化 2）分子量的测定 3）脱盐及去除小分子杂质 4）溶液浓缩 5）去热源物质 LogM A B C LogM测 Ve 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关， LogM=（k1-k2）Ve　（Ve为洗脱体积） 先测得几种标准蛋白质的 Ve，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出 待测样品的Ve，查标准曲 线即可确定分子量。 第四章 层析技术 第一节 吸附层析技术 第二节 分配层析技术 第三节 凝胶过滤层析技术 第四节 离子交换层析法 第五节 亲和层析法 第六节 高压液相层析（HPLC) 一、原理:离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。 离子交换层析法 纤维素— O — CH2 — COO-—Na+ 图 纤维素阳离子交换剂组成示意图 离子交换层析的基本原理示意图 + + + + — — — + + + + + + + + + + — + + + 二、离