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第一章 生物化学实验 实验一、细菌碱性磷酸酶（BAP）在大肠杆菌中的诱导表达和Western检测 Ⅰ 外源基因在大杆菌中的诱导表达 一、实验目的和要求 通过本实验了解外源基因在原核细胞中诱导表达的一般策略，并掌握IPTG诱导的一些要素。 二、实验原理 将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在E. coli 中表达。先让宿主菌生长，阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG（异丙基硫代-β-D—半乳糖），阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS检测（本实验Ⅱ）或做Western-blotting，用抗体识别之（本实验Ⅲ）。 碱性磷酸酶是适于在pH约9-10的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷酸游离的磷酸脂酶的总称。它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶,是分子生物学中常用的工具酶之一。它的作用是催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA(或RNA)片段的5-Pi末端转换成5-OH末端，这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。而提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究。碱性磷酸酶有两种来源:一种是从大肠杆菌种纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,简称BAP)；另一种是从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase,简称CIP)。关于碱性磷酸酶的活性测定原理，实验手册的其它章节将有介绍。本实验中使用我们在应用基础研究中建立的表达重组His-BAP的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株，在IPTG的诱导下表达有活性的重组His-BAP并通过SDS和Western-blotting进行鉴定。  三、仪器与试剂 （一）材 料 BL21（DE3）大肠杆菌工程菌株 （二）仪 器 超净工作台，恒温水浴摇床，高速冷冻离心机，全自动高压灭菌锅，紫外分光光度计。 （三）试 剂 1、 LB（含50 ug/mL Amp）培养基 2、 0.1mol/L IPTG 3、 STE缓冲液：0.1mol / L,? 10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0) 4、 1×SDS上样缓冲液 四、操作方法 1．含有重组表达载体的BL21（DE3）大肠杆菌工程菌株在LB（含50 ug/mL Amp）培养基中预培养过夜（注意取菌株要在超净工作台中进行） 2．20 mL LB 培养基加入10 uL 100 mg/mL Amp，使终浓度达50 ug/mL，并加入700uL过夜培养的上述LB培养液进行1:30扩大培养。 3．于37℃恒温摇床，180－200rpm，培养70－80min左右，使其OD600 达到0.5-0.7。 4．加入210uL 0.1mol/L IPTG，终浓度达1.0 mmol/L，进行外源基因的诱导表达。于28℃恒温摇床，180－200 rpm，继续培养4～5h。 5．诱导前和诱导后每隔1h取1mL菌液，12000rpm离心1min，收获菌体，弃上清。 6．500uL STE重悬菌体，12000rpm离心1min，收获菌体，弃上清，吸干残液。 7．100uL 1×SDS上样缓冲液重悬菌体，100℃煮沸5min。 8．12000rpm离心1min，－20℃存放。  思考与讨论 培养的菌液最佳状态为怎样？在试验中用什么进行衡量？ Ⅱ SDS—PAGE 检测表达蛋白 一、实验目的和要求 1. 实习SDS—PAGE的基本操作，掌握垂直板电泳的操作技术； 2. 学会用SDS—PAGE初步检测目的蛋白。 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶是单体丙烯酰胺（acrylamide,简称Acr）和交联剂（cross-linker）又称为共聚体的N,N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE）。在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠sodium dodecyl sulfate,简称SDS），则将分子所带电荷差异这一因素除去，分子在凝胶上泳动速度完全取决于相对分子质量。 蛋白质与SDS结合后，均带有负电荷，且具有相似的形状，在电场下，按相对分子质量大小在凝胶胶上排列。蛋白条带经考马斯亮蓝R250染色后形成肉眼可见