RNA干扰和siRNA转染实用.pptVIP

RNAi和siRNA转染 Dr.Jim Engreen Biosystem Co.Ltd. 内 容 第一部分 RNAi实验基本概念 第二部分 RNAi实验具体设计 第三部分 siRNA转染过程相关问题及解答 第一部分RNAi实验基本概念 主要内容 1.RNAi的概念 2.RNAi的启动途径 3.非哺乳动物系统的RNAi实验 4.哺乳动物系统的RNAi实验 5.RNAi效应表现 1.RNAi的概念 RNA干扰(RNA interference)是双链RNA（dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录水平基因表达抑制。 2.RNAi的启动途径 (1) dsRNA途径 (2) siRNA途径 (3) shRNA表达载体途径 (1) dsRNA途径 dsRNA:在非哺乳动物系统中，大于30bp的长双链RNA(dsRNA)进入细胞后，经过胞质内双链特异性核酸酶Dicer水解成21-23bp的siRNA，进一步导致RNAi的发生。 但在绝大多数哺乳动物系统中，超过30bp的dsRNA会引起细胞潜在的抗病毒机制（干扰素效应）。 (2) siRNA途径 小干扰RNA，长21-23bp，双链。 作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介导的静默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA，最终导致特定基因表达的抑制。 (3) shRNA表达载体途径 shRNA表达载体在细胞内表达shRNA后，在Dicer作用下形成siRNA分子，导致RNAi的发生。 3.非哺乳动物系统的RNAi实验 如线虫、果蝇等可通过与靶基因序列互补的长链dsRNA（通常200bp）介导RNAi的发生 。 长链dsRNA通常可以通过体外转录获得。 4.哺乳动物系统的RNAi实验 通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的基因表达抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi实验可以在此时间段获得结果，而且可以通过再次转染获得超过1周的基因表达抑制时间。 通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的基因表达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择shRNA表达载体较为合适。 5.RNAi效应表现 RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学方面表现。 第二部分哺乳动物系统的RNAi实验设计 主要内容 1. 需要短期抑制还是长效抑制? 2. 采用siRNA进行实验的途径 3. 构建shRNA表达载体进行实验 4. siRNA设计需要注意的问题 5. 脱靶效应 6. 转染是RNAi实验的瓶颈 1.需要短期抑制还是长效抑制? 1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作用的时间到2周。 2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较好，效应持续时间长。 2. 采用siRNA进行实验的途径 (1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最方便 (2) 体外转录 (3) Dicer/RNaseⅢ酶解 这三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率 3.构建shRNA表达载体进行实验 需要构建相关质粒 可利用载体上的抗生素等标记筛选，做长效表达 不能做荧光标记，无法直观知道转染效率 4.siRNA设计需要注意的问题 (1) siRNA序列设计 (2) 阴性对照的作用 (3) 阳性对照的重要性 (4) siRNA荧光标记的问题 (1) siRNA的设计 理想的siRNA序列是特异性强，抑制效率高。 可通过检索相关基因的文献报道序列，或者通过在线设计软件进行，一些技术力量较强的化学合成公司可提供免费设计。 如果有可能，多设计几条siRNA 序列，以筛选最特异、最有效的siRNA序列。 (2) 阴性对照siRNA的作用 阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起任何基因表达的改变，从而反映出小分子RNA片段进入细胞后对基因表达的非特异影响。 (3) 阳性对照siRNA的重要性 阳性对照siRNA采用确认有效的siRNA，针对某些较容易检测基因，如甘油醛－3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因； 用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条件、检测方法是否可行等； 阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染体系进行RNAi实验时很重要，容易被忽视，缺乏阳性对照siRNA，实验出问题无法找原因，耽误时间。 (4) siRNA荧光标记的问题 采用荧光标记的siRNA可以用来确定转染效率和优化转染条件，这种方法操作快速，实验费用也不高，但由于荧光标记的siRNA摄入与siRNA导致的抑制效果时常会出现不相关性，这种情况在某些细胞系和应用某些