05 双向电泳操作步骤及相关试剂配制.doc

双向电泳操作步骤及相关试剂配制 A． 实验过程 一、实验原理： 2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。 二、实验步骤： 1.样品的溶解 取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300μl裂解液(1mg蛋白:100μl裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10～15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70μl，—80℃保存。 2.Bradford法测蛋白含量 取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。 取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0μl,5μl,10μl,15μl,20μl 的BSA溶解液，另2管中分别加入2μl的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80μl），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如： 编号 蛋白量（ul） Buffer(ul)Bradford(ml) OD595值 1 0 4 0 2