变性高效液相色谱法.pptVIP

杨新怡 郭俊怡 梁茂丽 黄云丽 龚艳清 曹籍文 基因探针技术 聚合酶链反应PCR技术 FISH技术 生物芯片技术 毛细管电泳技术 变性高效液相色谱技术 遗传学诊断技术： 变性高效液相色谱(DHPLC)技术 DHPLC技术：使用的仪器设备是由 HPLC 仪、 PCR 仪、 生物纳米材料吸附分离柱等组合而成 ,是具有准确、 灵敏、高通量、 自动化等特点的遗传病诊断和分析系统。它将作为一种常规分析工具被越来越多的医疗和检测机构用于对双链 DNA 片段大小及可能的未知单核苷酸多态性(SNP)和突变进行快速分析分离鉴定。 基本原理 通过一个独特的 DNA 色谱柱 — — — DNA Sep 柱进行核酸片段的分离和分析。DNA 分子带负电荷 ,而分离用色谱的固相呈电中性疏水性 ,因此 DNA 分子本身不能直接吸附到柱子上。而一种充当 “桥梁”作用的离子对试剂 TEAA(三乙铵醋酸盐) 可以帮助DNA 分子与柱子固相填料表面分子结合 ,其阳性铵离子可与 DNA 相互作用 ,同时其烷基链又与柱子的疏水表面相互作用 ,这样 DNA 分子越长 ,结合的TEAA 越多 ,与固相结合得越牢固 ,越不易被洗脱 ,但羟基链与固相结合的强度会随着流动相中乙腈浓度的增加而减弱 ,且大小相同的片段其与柱子结合的难易程度也会因其序列不同而不同。 在最终形成的色谱图中 ,带有突变序列的样品呈现出异源和同源双链两个色谱峰 ,而不含突变序列的样品则只有同源双链一个峰。若出现与野生型或阴性对照不同的 DHPLC分离结果 ,说明检测样品含有突变序列 ,故 DHPLC技术为快速确定检测样品中是否带有突变序列提供了一种简便而直观的途径。 用于单碱基替换或单核苷酸多态性(或SNP) 、 小片段缺失或插入等多种基因突变的检测； DHPLC 基因扫描技术可用于筛查生殖细胞系和体细胞系的遗传变异 ,而像特定位点 DNA 甲基化状态的改变等遗传现象也可用在 DHPLC 基础上建立的方法来检测； DHPLC与其他技术联合应用 ,还可寻找出更多的疾病相关基因 ,如诱发耳聋的等位基因突变和食管癌中肿瘤抑制基因 p53 突变； 目前已被广泛用于临床疾病诊断 ,特别是用于肿瘤相关基因的筛选 ,如已成功地筛选出乳腺癌相关基因和精神分裂症突变基因 DHPLC技术在遗传学诊断中的应用 DHPLC筛查疾病相关基因的应用遗传异质性是很多复杂疾病的特点 ,而 DHPLC技术因其准确性高和敏感性强 ,是筛查遗传异质性疾病相关基因突变的理想方法 。 这在对进行性神经性腓骨肌萎缩症 (CMT) 相关基因突变的研究中得到了很好的体现与 DNA 直接测序比较 ,应用DHPLC技术对 168 名 CMT患者进行 4 个基因(PMP22、 MPZ、 G JB1、 EGR2)的筛查 ,结果无一突变漏筛 ,且还检测到一些 DNA 测序所未能检出的新突变。通过 DHPLC收集异源双链部分 ,加大样品中突变等位基因的含量 ,再通过 DNA 测序确定这些新突变类型。 DNA 测序仍然是突变或SNP分析的黄金标准方法,但是在对某些嵌合体病和肿瘤病人的体细胞基因变异以及病理性线粒体DNA 进行检测时,因为突变的等位基因所占比例可能过低,以目前DNA 测序的分辨能力很容易漏检。 Jones 等确实观察到,取自结节性硬化症病人的样本经DHPLC 多次检测均呈杂合峰形,而采用DNA 测序未能加以证实。 Wolford 等用基因组DNA 池方法证实,DHPLC 可以成功检测出20 个等位基因中的1 个变异等位基因(变异频率仅5 %) 。 Kwok等研究表明,变异等位基因频率为20 %时,DHPLC 的检出率为100 % ,而测序仅能检出80 %。 嵌合体存在时,DHPLC 应是首选的变异检测工具 近年来发展起来的产前诊断技术对遗传病诊断、 遗传咨询和防治工作都极为重要。而 DHPLC作为一种新的遗传病检测技术具有特殊的优越性。 DHPLC敏感性和特异性可达96 %～100 % , 明显高于其他常用的变异检测技术； 同时选择多个温度条件进行 DHPLC分析 ,还能进一步增加变异检出率； DHPLC 可以成功检测出 20 个等位基因中的 1 个变异等位基因(变异频率仅 5 %)。 变异等位基因频率为 20 %时 ,DH2PLC 的检出率为 100 % ,而测序仅能检出 80 %。因此 ,若考虑到有嵌合体等存在时 ,DHPLC 应是首