第6章-目的基因克隆.pptVIP

第一节 PCR扩增法获得目的基因 一、RT-PCR法 常用RNA模板 常采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步抽提法 提取的总RNA中只有少部分是mRNA，大部分为rRNA和tRNA 采用亲和层析法 基因特异引物（gene specific primer，GSP） 多聚寡核苷酸引物（oligo (dT) primer） 随机六核苷酸引物（random hexamer primer） 以合成的cDNA单链为模板，采用基因特异引物进行常规PCR扩增 过程： 2. 三种不同引物引导的RT-PCR 3. 已知基因N端部分序列RT-PCR 目的基因的DNA序列未知，但其编码蛋白的N端部分氨基酸序列已知 根据氨基酸序列设计的简并引物和oligo（dT）进行RT-PCR 二、其他PCR法 获得的目的基因的DNA片段不完整，仅知道基因上一小段序列信息时 1. 反向PCR 用于扩增已知目的基因序列侧翼的DNA片段 1. 锚定PCR 根据已知序列设计的基因特异引物 在普通PCR过程中增加了连接的步骤，即通过连接反应加上去一个公共接头 5’端之间的未知序列 5’RACE 第三节 基因组DNA的克隆 基因组文库构建 ● 概述 定义：某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌的群体中，这个群体就称为该生物基因组的文库(genomic library) 目的： a）分离有用的目的基因（可培养细菌＋未可 培养细菌） b）保存某种生物的全部基因（可培养细菌） ● 一般流程 ● 一般流程 ●高分子量环境样品DNA的准备 PFGE分离大片断DNA分子 ●载体的选择和制备 BAC 载体特点 对插入大片断的外源DNA（300 kb）能够复制严谨、稳定 通过电激发转化大肠杆菌的效率较高 已超螺旋状态存在，分离抽提比YAC容易 克隆中几乎不存在嵌合体(Chimrism) ●连接 克隆片段的大小与构建文库克隆子的关系 ｌｎ（１－ｐ） 文库实际克隆数（N）＝ 　　　　　　　　　　　　ｌｎ（１－ｆ） 其中p为期望的可能性，f 为ＤＮＡ片段平均长度与基因组ＤＮＡ 总长的比值 目标DNA和载体浓度的确定 大片段DNA 是否能有效连接在载体上主要取决于插入 DNA 片段与载体的比例, 对于不同生物采用的比例不同, 大多数BAC 文库采用1∶5 - 15 (摩尔比) ● 转化 制备用于电转化的感受态大肠杆菌细胞 ● 阳性克隆的挑选 可通过lacZ 的α- 互补所形成的蓝白菌落筛选阳性克隆。 ●BAC 文库的鉴定 　BAC 文库的鉴定 BAC 文库的快速筛选 基因组文库在环境微生物分子生态中的应用与意义 海洋环境BAC文库发现了海洋变形细菌视紫红质的结构模型 什么叫做cDNA文库？ 以mRNA为模板，在体外经逆转录酶催化反转录生成cDNA，与适当载体连接后转化受体菌并繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 可认为是：不包含内含子的基因组文库。 构建cDNA文库的基本步骤： ①制备mRNA； ②第一链cDNA合成； ③第二链cDNA的合成； ④双链cDNA的修饰及克隆； ⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库的代表性以及重组cDNA片段的序列完整性。 内 容 提 要 一、RNA提取与质量鉴定 二、cDNA文库构建 三、cDNA文库的质量评价 一、RNA提取与质量鉴定 1. 细胞总RNA的提取 1. 细胞总RNA的提取 cDNA文库构建的关键步骤：提取高质量的总RNA。 RNA易降解：所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理 实验室常用：异硫氰酸胍法（ Trizol ） 2. mRNA的分离纯化 常规方法： oligo（dT）-纤维素柱层析分离法 磁珠吸附洗脱法 3. RNA的质量鉴定 总RNA：紫外分光光度法、电泳法 二、cDNA文库构建 1. cDNA第一链的合成 1. cDNA第一链的合成 cDNA第一链的合成：mRNA在反转录酶的催化作用下得到cDNA； 常用的反转录酶：AMV、MLV ； 常用引物：oligo（dT）、六核苷酸的随机引物(dN)6、已知序列引物； 2. 第二链cDNA的合成 第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化； 常用方法有3种：自身引导法、置换合成法和引物合成法。 置换合成法 合成cDNA的第一链形成mRNA:cDNA杂交链； RNAaseH酶降解mRNA； mRNA链上出现切口，产生一系列mRNA引物