3第三章基因克隆载体3.pptVIP

第三章 基因克隆载体 作 业 列举所学的几种重要克隆载体的定义。 各种载体的特点是什么？ 列举质粒和噬菌体克隆载体构建的基本策略。 简述使用cosmid载体的基本程序。 * * 第三节 染色体定位整合克隆载体 质粒与病毒克隆载体的不足： 1、外源DNA的不稳定性 2、外源DNA插入染色体DNA位点的随机性 基因整合平台系统——基因定位同源重组(基因打靶) 整合平台：即受体细胞基因组上给定的DNA区域，是外源DNA 定位整合的位置 定位整合克隆载体：除一般质粒克隆载体必备的元件外，还含有一个或两个与整合平台DNA区域核酸序列同源的DNA片段（长度最好＞1kb） 一、定位整合克隆载体的几种模式 （一）内源平台双交换置换克隆载体 （二）外源平台双交换置换克隆载体 （三）内源平台双交换插入克隆载体 （四）内源平台单交换插入克隆载体 二、定位整合效率 与受体细胞的种属和同源DNA片段的长短有关 整合效率偏低，有待改进 三、定位整合克隆载体 受体生物：原核生物蓝细菌、高等植物（拟南芥、水稻等）的原生质体、动物鼠的胚胎干细胞、人的细胞 整合平台： 内源　isiAB、cpcB2A2、hprt、rDNA 外源　hptΔ、aphⅡ （一）蓝藻染色体定位整合克隆载体 1、丝状蓝藻Calothrix sp.PCC7601　获得含藻蓝蛋白基因cpcB2A2的DNA片段，以之为同源序列，构建～ 2、从其cpc2操纵子中扩赠出cpc2启动区（约0.6kb）、同源DNA片段L（约1.2kb）和R（约1.15kb）构建如下载体： 3、Synechococcus 从sp.PCC7942获得含isiAB基因的约1.5kb的DNA片段，构建p ZL： 不含蓝藻源质粒复制起始位点，故不能在蓝藻细胞质中自行复制 （二）酵母菌染色体定位整合克隆载体 （三）植物染色体定位整合克隆载体 易于控制；避免插入失活或突变。 （四）动物染色体定位整合克隆载体 第四节 人工染色体克隆载体 一、人工染色体克隆载体含义和特点 “穿梭”克隆载体：含有质粒克隆载体所必备的第一受体（大肠杆菌）源质粒复制起始位点（ori），还含有第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。 特点：能容纳长达1000至3000kb的外源DNA片段。 二、人工染色体克隆载体的构建 YAC（酵母人工染色体） 常用载体：pYAC3、 pYAC4、pYAC5 三、人工染色体克隆载体的应用 构建基因组文库 基因治疗 基因功能鉴定