哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111.pptVIP

二、实验原理 1、哺乳动物组织DNA的提取：在EDTA（鳌合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞或组织，用去垢剂如SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂进行抽提纯化。污染的RNA通过RNase消化去除。根据本方法制备的哺乳动物基因组DNA约20～50 kb，适于作PCR反应的模板。DNA产量在0.5～3.0μg/mg组织之间。 2、多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术：ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反应过程见图。 模板DNA在94℃条件下变性形成单链； 在55℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；72℃下在耐热性DNA聚合酶Taq 酶催化下， 在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的DNA为模板进行同样反应，如次往复循环30次，由于每次循环目标DNA都以２n次幂扩增，30次循环后目的DNA的量增加106～7倍。成功的PCR反应要求反应有很好的特异性和相当的扩增效率。 要达此目的PCR反应要注意以下问题： ①DNA模板：反应中DNA量在50 ng～200 ng左右。且DNA纯 度较高，以增加反应特异性。 ②dNTP:反应体系中达100μM～200μM。 ③Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0 mM左右，浓度太低Taq 酶活力降低；太高反应特异性降低； ④引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20 nt左 右，Ｇ＋Ｃ含量在40 ％～70％之间，引物内部不能有回文 序列，引物３’端不能互补； ⑤Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性 DNA 聚合酶， 在95℃时30 min还有50％活力； ⑥变性温度：在93～95℃之间使模板充分变性。 ⑦复性温度：55℃左右，此温度选择是根据模板和引物配 对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因素。 ⑧延伸温度：70～72℃，为 Taq 酶最适反应温度。 6、将上清液转移到一个新离心管中，加0.6 mL 异丙醇。 充分混匀， 12000 g 离心 5 min （4 ℃ ）。 7、去掉上清，加入0.6 mL 70% 乙醇。颠倒离心管数次， 12000 g 离心 1 min（4℃）。 8、去掉上清，空气中干燥 DNA沉淀 15 min。 9、将DNA沉淀溶解于 100 μL TE 或水中。 10、浓度和纯度测定： OD260/OD280= 1.8-2.0； 1 OD260= 50 μg/ mL 2、在0.5ml薄壁管中，依次加入以下各成分： ddH2O: 18.0 ?L 10×buffer: 2.5 ?L dNTPs(2.5 mM) 1.0 ?L Forward primer (10?M) : 1.0 ?L Reverse primer (10?M) : 1.0 ?L Taq DNA 酶(5U/?L) : 0.5 ?L Template DNA(20ng/ ?L): 1.0 ?L 总体积 25 ?L 3、混匀后，离心2-3 sec，将PCR薄壁管放入PCR仪的 样品槽中，选择预先设定的程序，按START键启动 PCR仪。 4、采用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引 物扩增的特异性。 五、实验结果与分析 1、提取的猪肝DNA进行电泳后，采用凝胶成像系统 进行拍照并对电泳图谱进行适当的分析。 2、对PCR扩增的基因进行电泳后的图谱拍照并进行 合理的分析。 六、思考题： 1、为了获得较为完整的基因组DNA，在实验应注意 什么问题？ 2、简述PCR基本原理； 3、进行一次成功的PCR反应应注意哪些问题？ * * 实验二、哺乳动物组织 DNA 的快速分离与基因的 PCR 扩增 一、 实验目的 1、了解真核细胞中基因组结构与组成的复杂性；学会 并掌握从哺乳动物组织中提取基因组总DNA的原理 与技术，为PCR分析，RFLP分析，基因文库的构 建，基因检测等研究打下基础； 2、学习与掌握PCR扩增基因的原理和操作方法，了解