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第七章 克隆基因的表达及基因干扰 上海交通大学 倪培华 第一节 外源基因的表达 第一节 外源基因的表达 一、原核生物表达体系 一、原核生物表达体系 （一）对外源目的基因的要求 不应具有5′端非编码区以及内含子结构 （三）真核生物基因在原核细胞中的表达 1.非融合型表达蛋白 优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在 的蛋白在结构、功能以及免疫原性等 方面基本一致 缺点：易被细菌蛋白酶破坏 一、原核生物表达体系 常用的非融合型表达蛋白表达原核载体pKK223-3 抗氨苄青霉素基因 Tac启动子 SD序列 AUG起始密码 转录终止序列T1和T2 一、原核生物表达体系 2.融合型表达蛋白 优点：融合蛋白具有抗原 性可以作为抗原，可以抵 御细菌蛋白酶的破坏 一、原核生物表达体系 融合型表达系统主要有 His系统 GST系统 金黄色葡萄球菌蛋白A系统 β-半乳糖苷酶系统 麦芽糖结合蛋白系统 一、原核生物表达体系 　3.分泌型表达蛋白 　可防止大肠杆菌对表达产物的降解，而且能够减轻大肠杆菌代谢负荷和易于恢复表达产物天然构象 （四）包涵体 1.包涵体的形成 2.包涵体的分离与纯化 3.包涵体的复性 二、真核生物表达体系 （一）酵母表达体系 1、酵母表达载体 选择性标志 复制子 启动子 上游活性序列 终止序列 蛋白结构域 二、真核生物表达体系 2.酵母表达外源性基因的形式 非分泌型 分泌型 （二）哺乳动物细胞表达体系 1.哺乳动物细胞表达载体 (1)原核DNA序列 (2)启动子 (3)增强子 (4)剪接信号 (5)遗传标记 (6)终止信号和多聚腺苷化的信号 二、真核生物表达体系 二、真核生物表达体系 3.哺乳动物细胞的瞬时表达 和稳定表达系统 （1）COS细胞瞬时表达系统 （2）CHO细胞稳定表达系统 第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定 第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定 一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化  　 1.粗制品的分离纯化 　 2.精制品的分离纯化 二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化  1.酵母细胞内表达的重组蛋白质的分离纯化 2.酵母表达分泌型重组蛋白的分离与纯化 三、表达产物的鉴定 1.蛋白质样品的制备 2.SDS聚丙烯耽胺凝胶电泳 3.蛋白质的电转移 四、表达产物的鉴定 4.靶蛋白的免疫学检测 封闭 靶蛋白与第一抗体反应 与第二抗体反应 显色 第三节 基因表达干扰技术 第三节 基因表达干扰技术 一、反义核酸技术 一、反义核酸技术 （一）反义寡核苷酸技术 1.反义寡核苷酸的作用机制 (1) 抑制mRNA的翻译 (2) 抑制复制或转录 (3) 抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达 一、反义核酸技术 2、反义寡核苷酸的设计与合成 1）设计 ① 计算机软件预测RNA的二级结构 ② 利用寡核苷酸随机文库鉴别mRNA上的RNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNA进行设计 一、反义核酸技术 2）合成 ① 长度一般为15～25个核苷酸 ② G-C含量为60%～65% 一、反义核酸技术 3.反义寡核苷酸的修饰 最常见的是对ASON的骨架中的磷酸基团进行修饰 （1）硫原子代替磷酸二酯中的氧原子 （2）甲基修饰磷酸骨架 （3）聚酰胺键代替磷酸骨架 一、反义核酸技术 4.反义寡核苷酸的给药途径 （1）直接作用于培养细胞 （2）结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞 （3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌 肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径 （二）反义RNA技术 1.反义RNA的作用机制 (1) 抑制DNA复制 (2) 阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运 (3) 抑制mRNA翻译 (4) 使mRNA更易被核酸酶识别而降解 一、反义核酸技术 2.反义RNA的设计 与ASON相比，反义RNA的设计较为简单 （三）反义核酸技术的应用 需要完善或解决的问题： ①防止被核酸酶降解 ②需要进一步了解寡核苷酸进入细胞的确切机制 ③很多寡核苷酸易发生序列特异性和非序列特异性的结合 ④ASON是否会影响正常细胞的基因表达 ⑤用载体导入反义RNA在体内表达时，存在安全性和