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基于毛细管电泳的荧光检测SSR实验程序 毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又叫高效毛细管电泳（HPCE），是近年来发展最快得分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高压进行分离，创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten建立了毛细管等电聚焦，Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988～1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内，由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域对核苷酸、DNA、多肽、蛋白质（包括酶和抗体）的分离分析要求，得到了迅速发展。CE是经典电泳技术和现代微柱分离技术分离相结合的产物。 CE的优点可概括为三高二少：高灵敏度，常用紫外检测器的检测限可达10-3～10-15mol, 激光诱导荧光检测器则达10-19～10-2mol；高分辨率，其每米理论塔板数为几十万，高者可达几百万乃至千万；高速度，最快可在60s内完成，在250s内分离10种蛋白质，1.7min分离19种阳离子，3min内分离30种阴离子；样品少，只需nL（10-9L 本实验室利用ABI 3700 或 ABI3730测序仪，建立了高效SSR荧光标记检测平台，其实验流程如下： （1）SSR荧光引物的标记 直接标记：采用FAM，VIC、NED 3种不同颜色的荧光染料直接标记SSR引物对的一条链（并非任何引物链都可以标记荧光，选择第一个碱基不为G的引物链进行标记，也可由公司帮助选择），以确保PCR产物携带荧光而被检测。荧光标记引物由美国ABI公司合成。 标记M13接头链：合成引物时，在SSR引物序列上链的5’ （2）PCR扩增 直接标记荧光的SSR引物扩增同普通PCR。 带M13 链SSR引物的扩增分两次进行，其方法参照Schuelke（2000）提供的巢式PCR（Nested PCR）略做修改。具体如下： 第一次扩增： DNA (20ng/μl) 2.0μl Buffer (10×) 1.0μl Mg2+ (25mM) 0.8μl R-primer (2μM) 1.2μl F-primer (2μM) 0.12μl dNTP (25mM) 0.10μl Taq (5U/μl) 0.12μl ddH2O 4.66μl Total 10.0μl 第一次PCR程序： 94℃ 94℃ 30sec An. T 30sec ×30 72℃ 72℃ 第二次扩增：以第一次扩增产物为模板 M13 (2μM) 1.8μl Buffer (10×) 0.1μl Taq (5U/μl) 0.08μl ddH2O 0.12μl Total 2.1μl 第二次PCR程序： 94℃ 94℃ 30sec 53℃ 30sec × 72℃ 30 72℃ （3）荧光检测 扩增产物的纯化 毛细管电泳对DNA的纯度要求非常严格，必须对扩增产物进行去除残留盐分、蛋白质、去污剂（SDS等）及RNA等的纯化处理。具体步骤如下： 选择不同颜色的荧光标记引物，根据扩增产物分子量大小的不同，混合纯化。取2μl PCR产物（若采用384孔板纯化，则取1μl PCR产物），加入3倍的无水乙醇，轻轻震荡混匀2-3mins，3000rpm 离心30mins； 轻轻倒出液体，倒置离心管片刻后，700rpm离心30-60s（若采用384孔板，则需500 rpm），以甩干液体； 加入60μl 70％乙醇，轻轻振荡混匀2-3mins，3000rpm 离心10mins； 轻轻倒出液体，倒置离心管片刻后，700rpm 离心30-60s（若采用384孔板，则需500 rpm），静置5mins； 加入60μl dd H2O（若采用384孔板，则需加入30μl dd H2O） （dd H2O的体积可根据荧光检测信号的强弱适当调整），振荡混