粗糙链孢霉生活史及.ppt

实验二 粗糙链孢霉生活史及杂交 * ppt课件 ［一、实验原理］ 粗糙链孢霉属于真菌中的子囊菌纲。粗糙链孢霉的菌丝体是单倍体（n=7），每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。由菌丝顶端断裂形成分生孢子。 分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一个核，大型分生孢子中含有几个核。分生孢子萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始，这是粗糙链孢霉的无性生殖过程。 * ppt课件 链孢霉（Neurospora crassa）的生活史 图8-19 * ppt课件 粗糙链孢霉的菌株有两种不同的接合型，用A,a 或mt+, mt-表示，他们受一对等位基因控制。不同结合型菌株的细胞接合产生有性孢子，这过程称为有性生殖。有性生殖可以通过两种方式进行。 一是产生原子囊果，内附有产囊体，若另一接合型的分生孢子落在这原子囊果的受精丝上时，分生孢子的细胞核进入受精丝，到达产囊体，形成接合型基因的异核体。 二是不同接合型的菌株的菌丝连接，两种接合型的细胞核发生融合形成合子，产生子囊果。 * ppt课件 其中，1 和2 是未交换的，称第一次分裂分离子囊；3-6 都是发生交换的，称第二次分裂分离子囊。 因此，统计第二次分裂分离子囊占总子囊数的比例，乘以0.5，就可决定某一基因与着丝粒之间的重组值。重组值去掉%（即乘以100），即为该基因图距。 粗糙链孢霉的子囊和子囊型 * ppt课件 粗糙链孢霉的子囊和子囊型 * ppt课件 本实验用赖氨酸缺陷型（记作Lys-）与野生型（记作Lys+）杂交，得到的子囊孢子分离为4个黑的（＋），4个是灰的（-）。黑的孢子是野生型；赖氨酸缺陷型孢子成熟迟，所以呈灰色。根据黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列顺序，可有6种子囊类型。 子囊型（1）和（2）的产生如图。第一次减数分裂（M1）时，带有Lys+的两条染色单体移向一极，而带有Lys-的两条染色单体移向另一极。Lys+/Lys-这对基因在第一次减数分裂时分离，称第一次分裂分离。第二次减数分裂（M2）时，每一染色单体相互分开，形成四分体，顺序是＋＋——或——＋＋，再经过一次有丝分裂，成为（1）和（2）子囊型。形成这两种子囊型时，在着丝粒和基因对Lys+/Lys-间未发生过交换，是第一次分裂分离子囊。 * ppt课件 图中（3）和（4）的形成。由于Lys基因与着丝粒间发生了一个交换，Lys+/Lys-在第一次减数分离时没有分离，到第二次减数分裂（M2）时，带有Lys+的染色单体才和带有Lys-的染色单体相互分开，所以称为第二次分裂分离。然后再经一次有丝分裂，形成4个孢子对，顺序是＋＋--＋＋--或--＋＋--＋＋。这是第二次分裂分离子囊。 （5）和（6）子囊型的形成与（3）和（4）类似，也是两个染色单体发生了交换，不过交换不是发生在第2条染色单体与第3条染色单体之间，而是发生在1，3或2，4两条染色单体之间。 * ppt课件 粗糙链孢霉lys+与lys-杂交子囊孢子的排列顺序 (1)、(2)为非交换型 (3)、（4)、(5)、(6)为交换型子囊 (7)、（8)、(9)、(10)是由转换造成的异常比例 * ppt课件 ［二、实验目的］ 1． 掌握粗糙链孢霉的杂交技术； 2． 统计杂交结果，计算基因图距。 * ppt课件 [三、实验材料] 粗糙链孢霉野生型菌株，Lys+,接合型A. 粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株Lys-,接合型a. * ppt课件 [四、实验器具和药品] 1.器具：显微镜，钟表镊，解剖针，接种针，载玻片，试管，培养皿。 2.药品： ５％次氯酸钠。 * ppt课件 [五、实验步骤] 1、菌种活化：把野生型和缺陷型菌种从冰箱取出，分别接在两支土豆培养基试管斜面上， 28OC温箱培养５天。培养到菌丝上部有分生孢子产生。 ２、杂交： （１）同时在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝，25 OC温箱进行混合培养。注意要贴好标签，写明亲本菌株及杂交日期。 （2）杂交后５－７天就能看到许多棕色的原子囊果出现，以后原子囊果变黑变成子囊果。 （3）在７－１４天左右，就可在显微镜下观察。 * ppt课件 另外一种方法：在杂交培养基上接种一个亲本菌株，25 OC培养５－７天后即有原子囊果出现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，悬浊于无菌水中（近于白色的悬浊液），将此悬浊液加到形成原子囊果的培养物表面，使表面基本湿润，继续25OC培养。原子囊果在加进分生孢子一天后即可开始增大变黑成子囊果，７天后即成熟。 ３、显微镜观察步骤： （１）在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分生孢子飞扬。 * ppt课件 （２）取一载玻片，滴一滴５％次氯酸钠，然后用接种