玉米原生质体转化及原核表达方案.docx

玉米原生质体制备及瞬时转化1 玉米 玉米原生质体制备及瞬时转化 2纯化转化用质粒，浓度达到1 μg/μl； 3 配制10-20 ml酶液和40-80 ml 0.6 M甘露醇平衡液（Mannitol）等，最好用灭过菌的瓶子； 4 取第二片叶子（第三片叶子也行）中间6-8 cm，切下后浸在0.6 M Mannitol中，用0.6M Mannitol 浸湿切口，将20片左右的叶片叠在一起，用刀片切，越小越好，将切下组织的放入0.6 M Mannitol中，平衡10 min，用200目筛子过滤后（过滤除去Mannitol，留下组织），将切碎的组织投入酶液中，抽真空30 min，在250 ml的三角瓶中用牛皮纸或锡箔纸包裹摇床上40 rpm，28℃，2-4 h，最后80 rpm，5 min，使原生质体尽量分离。镜检确定酶解效率。摇完后酶解液变绿（绿叶）或者变黄（黄化叶）。 5 经200目筛子过滤，滤入10 ml离心管中，镜检原生质体，约25-35 μm，20×和40×能看到10-40个即可，圆形大小不一； 6 水平离心，110 g，4-5 min，(加速1，减速1)，室温或16℃均可（离心完后可见明显的混浊，沉淀在管底），弃上清（用枪头吸取），慢慢沿管壁加入4 ml W5溶液，轻轻摇晃，悬浮沉淀，水平离心110 g， 4-5 min，(加速1，减速1)，室温或16℃均可； 7 弃上清（用枪