有机酸氨基酸提取及测定.docxVIP

南京农业大学 黄瓜枯萎病研究 这是我们摸索改正后的有机酸氨基酸的提取及测定方法： 黄瓜植株组织中有机酸的提取：提取方法比照DelaFuente等（1997）以及Lanoue等（2010）并进行改进，称取冷冻于液氮中的黄瓜各部分组织鲜样0.5g左右，于研钵中研磨，用4ml 80%甲醇提取，提取后转移至离心管中，离心，吸上清，过0.45μm有机相滤膜，过滤至液相小瓶中待用。液相小瓶用甲醇润洗2~3遍，超纯水润洗2~3遍，并超声处理，烘干后使用。将盛有样品的液相小瓶置于-20℃冰箱储存直至分析时取出。 黄瓜植株组织中有机酸的测定：通过HPLC方法进行测定，比照Ling等（2011a）的方法进行修改。用于液相色谱分析的有机酸标准样品有：草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和延胡索酸。配置成不同浓度梯度的混标。 有机酸样品通过液相色谱仪（Agilent 1200，USA）测定；色谱柱为XDB-C18（4.6×250 mm，Agilent，USA）；紫外检测波长为210 nm；柱温为40℃；流动相为5 mM H2SO4（A）和100%甲醇（B），进行梯度洗脱。梯度洗脱程序如下： 0 min，95 % A+5 % B，流速0.4 ml min-1 →10min，90% A+10% B，流速0.4 ml min-1 →15min，90 % A+10 % B，流速0.4 ml min-1 →16min，