强筋益髓灵对大鼠截瘫作用机制的研究.docxVIP

强筋益髓灵对大鼠截瘫作用机制的实验研究 杜立建 ，冯胜格2,王扬彳吴俊喜 （1. 石家庄市中医院；2.石家庄炎 黄中医研究院；3.河北师范大学校医院；4河北省中医院 审校） 关键词：强筋益髓灵截瘫细胞凋亡 神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibri 11 ary acidic protein, GFAP） 截瘫，是指脊髓损伤后，受伤平面以下双侧肢体感觉、运动、反射等消失和膀胱、肚门 括约肌功能丧失的-?种病症。其中，上述功能完全丧失者，称完金性截瘫，述有部分功能存 在的，称不完全性截瘫。早期为弛缓性瘫痪，约3?4周后，逐渐转为痉挛性瘫痪。截瘫病 因与脊髓外伤或本身病变有关。 1材料： 1实验动物：南方医科人学实验动物中心（许可证号：SCXK （粤）2004-0020）提供的SPF 级健康成年SD大鼠120只，体1.0^1. 6kg,随机分为5组（即空白组、模型组、药物对 照组、大剂量治疗组、小剂量治疗组），每组24只。每口定量供给混合动物饲料和充足水， 在安静、通风、清洁环境下分笼饲养，饲养坏境温度控制在22°C?25°C,相对湿度40%? 70%。 1.2实验药物：强筋益髓灵（由黄代30.制马钱子5g、人参20g、口术20g、胆星10g、 土鳖虫12 g、水蛙10g、地龙15g、僵蚕12g、小口花蛇1条、娱蚣3条等组成），等组成。 由石家庄炎黄屮医研究院提供，并由石家庄炎黄屮医研究院制成汤剂。银杏注射液5ml/支, 由山西银湖制药有限公司提供牛产批号：104098。 1.3实验试剂及仪器：GFAP试剂盒（批号华美生物公司；即用型兔抗人鼠多 克隆GFAP抗体（工作浓度为1:100）及ABC试剂盒均由武汉博丄徳牛?物工程公司提供;SP 试剂盒 北京中山公司；DAB显色剂（批号北京中山公司TUNEL凋广试剂盒 （RD公司） 1.4 实验器材:KU0TA13100 高速离心机 Beckman； 58108 型离心机 Eppendorf； Milli-QUF 纯水机France； -20°C冰箱SANYO；干燥箱湖北黃石医疗器械厂；DJ-1磁力搅拌器 江苏金坛荣华仪器制造有限公司；PB203-E精密天平Mettler Toledo （shanghai） ； PHS - 3CpH 计上海康仪仪器有限公司；紫外透射分析仪上海天能公司；Kodak EDAS 290数码照相凝 胶成像系统Kodak；低温髙速台式离心机KUBOTA；手掌式离心机M1LL1PORE； WH-861旋涡 混合器上海市环球物化仪器厂 实验方法 2. 1实验动物模型制作：适应性喂养7天后，除空口组外，其余四组均行体积分数为0. 15 的水合氯醛腹腔注射麻醉（300 mg/kg）人鼠，以T9?T11节段骨性标志为小心，沿棘突做 纵行切I」约4 cm,切开皮肤及浅筋膜并皮下游离，于T10节段处，用锐利刀片于硬膜外快 速切割、完全横断脊髓，切除2咖脊髄疔段，并见大鼠尾巴痉挛性摆动，双下肢及加体回缩 扑动后，双下肢瘫痪，表明脊髓全横断模型制备成功，医用明胶海绵填充脊髓断端间隙。 2. 2试验分组处理情况：空白对照组：牛理盐水灌胃1次/日，剂量2ml;模型组：生理盐水 灌胃1次/口，剂量加1；药物対照组：银杏注射液静脉注射1次/FI，剂量5ml;大剂量治疗 组：中药强筋益傩灵灌胃1次/LI,剂量5ml (40g/kg);小剂量治疗纽：中药炎黄四虫通脉 灌胃1次/日,剂量5ml (20g/kg)，喂养8周。 2. 3实验指标及测定方法 2. 3. 1川改良的Tarlov法评价造模后24及8周后观察大鼠下肢运动功能情况:Tarlov评分 ⑴：测评大鼠后肢运动功能状况。0分：没有口主性运动；1分：仅有髄、膝关节的非反射 性运动；2分：有瓠、膝、距小腿(踝)4个主要关节的运动；3分：能主动支持体质量和 不协调步态，或偶尔出现协调步态；4分：前肢和后肢协调的步态，行走时有趾间关节的运 动；5分：正常步态。 2. 3. 2光镜下观察脊髓组织的病理形态学改变:氯胺酮(30mg/kg)静脉麻醉下，行4%多聚卬醛 +0?2%戊二醛液经左心灌注处死，取出脑与脊髓，置于相同灌注液中4°C下再固定48小时。 解剖显微镜下将大鼠脊髓(C1?T6)则行3mm层厚轴位切开，肉眼观察记录。制作6 u m厚连续 切片，HE染色,供光镜观察;部分标本再作成1伽3大小的组织块，2%戊二醛、1%四氧娥酸再 固定，618环氧树脂包埋、超薄切片，醋酸铀-枸椽酸铅染色，H-500透射电镜下观察。 2. 3. 3采用ABC染色测脊髓组织中GFAP的表达量。 免疫组织化学染色用ABC法进行检测 步骤：⑴切片常规脱蜡入水;⑵新鲜配制3%H202,室温处理3-10min,以消除内源性过 氧化