植物中病毒诱导的基因沉默.ppt

植物中病毒诱导的基因沉默 刘同坤 VIGS病毒诱导基因沉默 VIGS病毒诱导基因沉默 植物病毒可用作蛋白质过表达和序列特异的基因沉默的表达载体,两者都是功能基因组学研究工具. 病毒诱导的基因沉默(VIGS)的获得 1.构建载体 目的基因替换病毒中的与病毒复制、运动无关的基因 直接插入到病毒基因组中 2 植物的转化 农杆菌 3 病毒携带目的基因在植物中复制和传播 原理 RNAi 病毒复制过程中形成的双链RNA触发植物中与之具有高度序列一致性的mRNA降解。 Dicer酶 优点：1、试验周期短 2、可以研究T-DNA标记的敲除突变体和表达了沉默诱导基因的转化子中有致死表型的基因 缺点：1、不易获得针对特异物种的病毒载体 2、感病表型可能与靶基因沉默表型混淆 VIGS应用的病毒和载体 烟草：烟草花叶病毒TMV 大麦：大麦条纹花叶病毒barley stripe mosaic virus 拟南芥：卷心菜曲叶病毒 cabbage leaf curl virus 番茄：烟草脆裂病毒tobacco rattle virus (TRV) 马铃薯：Potato virusX(PVX) 实验目的 构建适合不同植物（豆科）的VIGS载体 选用的病毒：Pea early browning virus (PEBV) 原因：1、与TRV同属 2、已建成带有GFP报告基因的表达载体 结果1、PEBV侵染克隆的构建 双元载体系统(binary vector system) 农杆菌介导的植物转化机理 本实验用的载体的构建 植物转化：农杆菌注射法（agro-inoculation） 植物转化：农杆菌注射法agro-inoculation 转化pCAPE1、pCAPE2-GFP保存的农杆菌液分别用含有50ng/μL卡那霉素和100ng/μL利福平的LB液体培养基培养过夜。 培养到OD=1.2-1.5时，取菌液加入到1.5mL离心管中，离心，用含10mMNaCl、0.1mM乙酰丁香酮、1.75mMCaCl2的培养基重悬，静置90min。 两种转化质粒的农杆菌等量混合。 注射植物。嫩叶用1mL注射器在远轴端挑叶背，但不挑破，吸取制备好的菌液注射。 检测转化体系 21天后，在注射叶子上面新长出来的叶子上检测到绿色荧光 说明转化体系成功。 结果2、八氢番茄红素去饱和酶基因（PDS）的沉默 PDS是产生类胡萝卜素的关键基因，沉默后产生光漂白现象 PsPDS:P. sativum中的PDS基因 现象 RT-PCR检测PDS mRNA水平的变化 讨论 最广泛应用的病毒是PVX TRV VIGS应用还主要用于烟草。说明烟草感染效率高，发展针对其它寄主的PEBV载体的难度。 农杆菌注射法的感染效率可达100%其高效性、可靠性为应用作高通量研究打下基础。 N. benthamiana中 PVX 、TRV 载体引起的突变4周后又恢复现象，导致沉默与回复表型共存，相比之下PEBV引起的现象稳定。