原核表达（中农大汪亚中）.docxVIP

原核表达步骤 目的片段连接上pET系列质粒后通过测序确定编码序列的准确性(T7通用引物)。 HTTP:///NEBcutter2/ 对编码序列进行稀有密码子分析。在线网页 /sumchan/caltor.html 对稀有密码子较多（一般大于15%）的载体建议使用Transetta（DE3）化学感受态细胞进行转化 对稀有密码子较少的构建载体使用BL21(DE3)化学感受态细胞 转化感受态细胞之后涂板（含抗生素的培养基，一般是卡纳或氯霉素），过夜培养后挑单克隆进行PCR验证。（挑克隆在10ul的无菌水里，混匀挑2ul进行pcr，剩下的8ul中加200ul的LB培养基活化）摇床条件（37度，200r） 将吸出鉴定准确的菌体1ul，到25ml左右的TB培养基中过夜培养。摇床条件（37度，200r） 对蛋白序列进行亲水性分析。在线网页 /cgi-bin/protscale/protscale.pl 一般来说亲水性好的蛋白，最后在上清中，而亲水性不好的蛋白会出现在包涵体中，最好先通多第8步来验证蛋白存在情况。包涵体蛋白提取步骤会繁琐点可能损失较多或者提取难度大写，接下来摇菌的量会比较多。 第四步中25ml全部转移到含有大量TB液体培养基中（培养基中含有抗生素浓度1mg/20ml，我们做的时候蛋白在上清样品培养基的400ml。，蛋白在包涵体中用了2L）摇床条件（37度，200r） 25m