原核蛋白的提取.docx

原核蛋白的提取 构建的原核表达载体转化BL-21或者Rosetta表达菌株，用保存的菌液或者单克隆接在相应抗性的LB培养基中，37℃过夜培养 将小摇的菌株接在250ml LB中，使OD达到0.1，加入对应抗生素。28℃摇菌，约2到3个小时后，待OD达到0.6时，用IPTG（0.2mM到2mM）诱导蛋白表达。同时加入40%葡萄糖溶液2~5ml，放入30/28/18℃摇床生长 注意，接大摇时，LB体积应小于四分之一的三角瓶体积，特别是对于分子量大的蛋白 次日集菌，4℃离心机6，000到8,000 rpm，离心10至15分钟集菌 倒掉上清，加入10至30ml（由菌量确定）的对应缓冲液重悬 800ml GST Binding Buffer（GBB）: 1M Tris·HCl（PH 8.0）50mM ：40ml 120mM NaCl 5.6g0.5% NP40： 4ml 800ml column buffer/MBP 标签： 1M Tris·HCl（PH 7.4）20mM :16ml NaCl 200mM: 9.35g EDTA 1 mM: 1.6ml 注意在提取时，都应该加入1mM的PMSF和DTT（His标签的蛋白不能加DTT） 细胞破碎 细胞破碎后的液体移入50毫升圆底管，用对应的缓冲液配平后12,000 rpm，4℃离心15分钟 对应的beads用缓冲液平衡2次后，每个样品中加入