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RTPCR常见问题分析 一 、 RT-PCR反应原理与方法 RT-PCR是将RNA反转录（RT）和以反转录产物cDNA为模板的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的DNA片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因的表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因cDNA序列等研究。 1 RT-PCR反应步骤： 第一，RNA提纯； 第二，RT逆转录； 第三，PCR聚合酶反应 2 RT-PCR方法 2.1 一步法：即反转录和PCR扩增在同一管内完成， 有助于减少污染，灵敏度更高 2.2 两步法：即反转录和PCR扩增分两步进行，首先从RNA模板反转录得到cDNA，得到的cDNA再进行一次或多次不同的PCR反应。 2.3 一步法与两步法区别： 一步法RT—PCR反应更加快速、灵敏，操作简便，污染率低，RNA二级结构减少，并且因为聚合酶有校正活性，从而降低了PCR反应的错配率。而在两步法中，两步法在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活性，同时可由一次反转录样品获得多个遗传信息，并且由于在第一步中将RNA反转录为cDNA，从而更易于保存。另外，两步法的整个过程比一步法更节省费用。 3 提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性： 3.1 首先应确定模板RNA完整性好，无DNA污染。 3.2 RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。 3.3 为了防止模板降解，可以在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。 3.4 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。 3.5 如果由于模板有二级结构，导致扩增效果不好，可提高逆转录反应温度。 3.6 设计引物时，避免在引物3′端含有互补序列，避免可以形成内部发卡结构的序列。 RT-PCR常见问题 问题一：RT-PCR仅有少量或没有产物 1.RNA被降解 分离无污染或高质量的RNA；提取RNA材料要尽量新鲜，防止RNA降解。 RNA提取后，应储存在100％甲酰胺中，如果使用RNase抑制剂，加热时＜45℃；pH＜8.0，否则抑制剂会释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 物 对策 2. RNA中包含 逆转录抑制剂 过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复;逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐;将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂; 对策 3.用于合成 cDNA第一链 合成的引物 的退火不充分 1.确定退火温度适合实验中所用的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。 2.对于基因特异性引物（GSP），可以试以下其他GSP，或换用oligo(dT)或随即六聚体确定GSP是反义序列。 对策 4.起始RNA量 不够 5. 多糖同RNA 共沉淀 增加RNA量;对于50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA; 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖; 对策 对策 6.RNA模板 二级结构太多 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火;提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对 ThermoScript可以到65℃。注意：不要在60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP;对于1kb的RT- PCR产物，保持反应温度≤65℃。不要在高于37℃时使用M-MLV;如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物; 对策 7.引物或模板 对残余的RNA 模板敏感 8.靶序列在分 析的组织中不 表达 9.PCR没有起 作用 在PCR前用RNaseH处理。 尝试其他靶序列或组织 对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物; 对策 对策 对策 10.PCR引物设 计较差 避免在引物3端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。 对策 11.富含GC的 模板 于GC含量50%的模板，使用PCRx Enhancer Solution。 对