PCR技术教程课件.ppt

PCR技术教程;一、PCR技术;一、PCR原理;2、原理;循环次数;　1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性，不　 　　　能修复错误的碱基配对，因此必须测序。需激活剂：Mg2+ 2、pfu DNA 聚合酶：有5’→3’和3’→5外切酶活性，出错率最低，但 　　　PCR产物平端。 　3、Taq Plus DNA 聚合酶：是Taq和pfu的混合物，Taq PCR产物3’端带－ 　　　A。 　4、引物：互补；引物长度；3’碱基序列必须与模板配对；尽量提高 　　　GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 　　　物二聚体。 　5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 　6、primer 5.0 　7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 　　　Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl） 　8、dNTP浓度　2.5 mM each;普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR;普通PCR仪;二、实时荧光定量PCR（Real-time quantification PCR）;原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 　　SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如Taqman探 　　针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，再　　 　　通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 　　的方法。 　　也就是通过荧光的变化，获得不同样品达到一定荧光信号（阈值）所需要的循环次数Ct（Cycle Threshold）。 　　Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。;1、荧光探针和荧光染料： 　　分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高，后者操作简单。;荧光定量PCR的优点;一对引物;变性（95℃）;DNA聚合酶;5’→3’外切酶活性；可将探针5’端的荧光基团切割下来。;荧光基团游离下来后发光了！;因为探针是完全与目的基因互补，当它被水解后就发光，因此发光的强度与目标基因量成正比。;只与双链结合，发光；不与单链结合，不发光。;　　随温度升高，DNA双螺旋结构降解程度的曲线即熔解曲线，可用对数图和线性图表示。在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解。 ;不适合染料法;卤素灯（白光）;定量;基线;荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上。;Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。;;绝对;处理与对照;定量PCR仪特点;定量PCR的实验因素;定量PCR实验要素： 目标基因：　未知样品 生成标准：　曲线标准品梯度 监控系统：　阳性对照 监控污染：　阴性对照 校准生物学误差：管家基因 校准物理误差：参比荧光（ROX） 降低其它误差：重复实验;ABI　7500;Real-time PCR 方法的应用;蛋白互作;三、;操作流程;我们班上的刘磊同学所拍