PFGE分型技术原理和标准仪器配置课件.ppt

PFGE分型技术原理和标准仪器配置;目录;基本原理;基本原理;基本原理;与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后可持续 1s 到 5min 左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以将其称之为脉冲式交变电场。目前PFGE装置有垂直脉冲场、电场翻转、旋转、钳位匀强电场（CHEF)等电泳系统。; PFGE方法用来研究细菌的分子流行病学特点，能够对全基因组进行 分析，最终分析的DNA超过90%，可以从整个基因组的角度考虑菌株 间的关系。 用稀有位点的限制性内切酶进行酶切可以获得菌种某亚种特有的电泳 图谱，是PFGE技术的显著优势。 灵敏、分型能力强：电场是不断改变的，有利于DNA的迁移 重复性好、分辨率高、结果稳定、易于标准化。“金标准” 相同的操作框架适用于多种菌，只需选择合适内切酶、优化电泳条件 即可。;参数设置; 脉冲时间是指电场在某个角度持续的时间。 脉冲场电泳的核心参数。通常实验中使用的脉冲时间为一个范围值，如：2－20S。 脉冲时间的变换可以是线性的或者是非线性的。 与电泳时间作区别，电泳时间通常为20hr左右，其根据是标准菌种H9812的20Kb片段距胶的下缘为1-1.5cm. ;脉冲时间—不同脉冲时间对带型的影响;随着电场夹角的减小，两个大片段DNA分离的更好。但同时小片段也在逐渐的压缩。所以为了兼顾不同大小的片段需要选择一个合适的电场角度。;电场夹角;电场强度;电泳温度;缓冲液类型;琼脂的种类以及琼脂的浓度;方法标准化;实验流程;;;;在使用细菌分型的结果进行暴发研究时是基于以下几个假设的： 1. 属于一次暴发的分离株来源于同一个祖先 2. 这些菌株应该具有相同的基因型 3. 流行病学无关的菌株应该有不同的基因型别 ;基因事件与条带变化;无法区分：分离株有相同的带型，包括条带的数目和位置。这些分离株为同 一菌株。 高度相关：如果PFGE带型仅有因一次基因事件引起的带型变化，这些菌株 就被定义为高度相关菌株。这些仅有两到三个条带变化的情况常 见于反复传代以及从同一病人中多次分离的菌株。 可能相关：PFGE带型与暴???菌株带型变化有两个独立的基因事件引起的条 带变化（通常是4到6个条带的变化）。这些分离株可能是遗传 上相关的，但是并不是紧密相关的，其流行病学关系也并不紧密。 这样的突变常见于分离自较长的时间段（大于等于6个月）或者 是大规模延伸暴发的病人中。 无 关：三个独立的基因事件引起的条带变化（7个或者是以上的条带变化）。;TENOVER原则的聚类方法;; 菌株分型研究不能代替流行病学研究，要将流行病学资料分析研究应作为基础。 两项工作虽分别进行，但是要综合在一起进行分析才能确定是否真正存在着暴发。 PFGE作为暴发菌株的鉴定是一种有效的方法，然而一旦收集菌株的时间跨度超过三到六个月，分型研究就转化为种群研究。 另外一些技术，如MLST，主要用于监测微生物种群随时间变化的特点。管家基因的突变是中性突变，不受环境选择压力的影响。近来，这两种方法经常被结合起来用于细菌的分型研究，有助于我们弄清楚暴发菌株是如何扩散的，以及各细菌种群是如何随时间变化的。;PFGE是一个操作步骤复杂的实验过程，除了操作人员的仔细认真和实验程序的标准化，还需要保证相关仪器和耗材的质量！！;PFGE需配备相关仪器;PFGE实验耗材;Thank you!