TILLING(定向诱导基因组局部突变)技术原理及其路线讲义教材.pptxVIP

TILLING（定向诱导基因组局部突变）技术原理及其路线中国农业大学齐孟文 TILLING是后基因组时代出现的，一种将烷基化试剂EMS或辐射诱导的位点突变技术，与特定基因的PCR扩增技术和突变单核苷酸多态性检测技术或下一代基因俘获高效测序技术相结合的反相遗传学方法。提供了一种几乎对所有物种都适应的、低成本、高通量和自动化的诱发突变筛选技术。该技术也可用于天然群体自发突变的筛选，称之为Eco-TILLING。图.基因诱变组学的正向和反向遗传学操作的路标。技术特点点突变是随机分布的饱和突变，可获得大量的等位基因系列，对长度很小的基因，复等位基因等具有独特的反向遗传学技术优势。诱变频率高，为筛选特定目的基因所需的突变群体小。不依赖农杆菌介导转化或内源标签系统，无需耗时的基因操作和繁琐的组织培养。但需要预先知道所研究基因的序列。操作流程 1）用甲基磺酸乙酯处理种子诱导位点突变； 2）播种诱变处理种子，按单株种植得到诱变M1代植株； 3）播种M1代种子得到诱变M2代植株，自交获得M2代种子并保存建库； 4）按单株提取M2代组织DNA，存放于96孔微孔板建库； 5）5-8倍混合单株DNA库，构建DNA样品池以增加扫描通量； 6）针对目标基因设计特异性引物，采用700nm和800nm荧光染料标记引物，对DNA目标区域进行PCR扩增； 7）PCR的扩增片段经变性、退火，得到野生型和突变