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内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 PAGE PAGE PAGE 1 分类号: Q78 编号: 本科生基因工程实验论文 碱性磷酸酶 碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 大肠杆菌中的表达 指导教师： 王郑 学 生： 阿迪雅 专 业： 生物工程 年 级： 2012级 2015 年 8 月 16日 碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 摘要 碱性磷酸酶( alkaline phosphatase，A P) 是一包含 2 个 Zn2 + 和1 个 Mg2 +的金属酶，纯化后的 AP 被广泛用于生命和医学科学等领域，如蛋白质标记、分子生物学及酶标记免疫分析等，是基因工程常用的工具酶。该酶广泛存在于动物、植物、微生物体内，在磷生物地球化学循环过程中有重要作用。本文主要介绍利用基因工程实验技术操作碱性磷酸酶基因，将pET-44a-BAP质粒上的碱性磷酸酶基因用PCR扩增出1369bp的碱性磷酸激酶基因片段，与pMD19-T载体连接后导入感受态的DH5α菌中筛选鉴定。用双酶切切下碱性磷酸激酶的成熟基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-his，导入?BL(21)DE3感受态菌中诱导表达碱性磷酸激酶蛋白质，用SDS鉴定。 关键词：碱性磷酸酶，基因表达，载体，大肠杆菌， SDS TOC \o 1-3 \h \u 25375 引言 4 25125 1实验材料 5 30002 1.1试剂 5 31069 1.2仪器 5 11226 1.3试验用具 5 12955 1.4菌种 5 29212 1.5质粒 5 27897 1.6常用溶液的配制 6 29235 2 方法 7 23362 2.1引物的设计 7 26446 2.2 碱性磷酸酶基因的PCR扩增 7 6451 2.3 DH5α和BL21(DE3)感受态的制备 7 15958 2.4 ?pMD19-T-BAP的构建及转化和检测 8 10155 2.4.1 PCR?产物(BAP)与pMD19-T（PCR?2.1）载体连接? 8 1504 2.4.2感受态细菌的转化 8 28498 2.4.3 pMD-19-T-BAP的鉴定（提取质粒使用tiangen试剂盒） 8 28344 2.5 pMD19-T-BAP的酶切和回收 9 9603 2.5.1 pMD19-T-BAP双酶切? 9 27041 2.5.2 pMD19-T-BAP双酶切胶回收? 9 3450 2.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测 10 5186 2.6.1 pET-his-BAP的构建 10 8223 2.6.2 pET-his-BAP转化BL21 10 30299 2.7 pET-his-BAP的诱导表达 11 14044 2.8 碱性磷酸酶表达的SDS检测 11 22961 2.8.1电泳槽的组装及配胶? 11 31321 2.8.2外源基因的诱导表达 12 6744 3 结果与分析 13 7209 3.1 碱性磷酸酶基因的PCR扩增 13 31293 3.2 pMD19-T-BAP的构建及转化和检测 13 23195 3.3.1 pET-his的质粒电泳检测 14 6692 3.3.2 pET-his酶切结果电泳分析 15 2124 3.3.3 pET-his双酶切胶回收电泳分析 15 2936 3.4 pMD19-T-BAP双酶切和胶回收分析 15 23865 3.4.1 pMD19-T-BAP的双酶切结果 15 18837 3.4.2 pMD19-T-BAP双酶切胶回收的结果? 16 17752 3.5 pET-his-BAP的构建及转化和检测 16 7802 3.6 SDS检测碱性磷酸酶的表达 17 16644 4.讨论 18 22025 5.致谢 18 19903 6.感想 18 31803 参考文献 18 引言 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)是一种非特异性磷酸单酯酶，能催化磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖，也能催化磷酸基团的转移反应[1]。AP广泛存在