目的基因的制备教学教案.ppt

第一节 目的基因的制备 4 通过PCR直接扩增出目的基因 前提:目的基因的全序列或其两侧序列为已知，合成一对与模板DNA互补的引物，扩增出DNA片段。 模板：基因组DNA，mRNA序列，或是已克隆到某一载体上的基因片段。为了克隆操作的方便或保证克隆后续工作需要，常常要在设计引物时对其两端作一些修饰，如 带限制性内切酶切点,某种启动子序列或起始或终止密码等,便于下一步的重组克隆和基因的表达和调控研究。 通过PCR直接扩增出目的基因策略 第一节 目的基因的制备 优缺点：与传统的DNA克隆方法比较，省时、省力, 但要求待扩增的DNA片段的序列必需是已知的，至少要求两端长约20bp的序列是已知的。另外，合成的DNA片段长度有限，一般在2kb以内，超过2kb时扩增效果显著下降。 如要大量扩增未知序列的特异DNA片段，或是更长的DNA片段，则须选择特殊类型的PCR策略。通常PCR反应有如下几种类型: 4.1 套式 PCR（nested PCR） 也叫巢式PCR，是指用两对引物扩增同一样品的方法。即在两对引物中，一对引物与靶序列的复性结合位点处于另一对引物扩增的DNA序列内，前者称为内部引物，后者称为外侧引物。一般先用外侧引物扩增一段较长的靶序列，然后以第一次扩增的产物为模板，再用内部引物扩增其中的部分片段。 套式 PCR较常规PCR灵敏度大大提高，同时也有较强的的特异性，假阳性极少。