阿司匹林抗氧化机制探讨.ppt

阿司匹林抗氧化作用机制的探讨 研究背景 阿司匹林是临床常用的抗炎`抗血栓药物, 其作 用主要是通过抑制前列腺素的合成及环氧化酶的激 活而实现的. 最新的研究显示阿司匹林还具有对抗 过氧化物的损伤`保护血管内皮细胞完整性的功能, 其作用可能与诱导某种保护性基因表达, 抑制活 性氧的反应, 特别是阻止铁介导的氧自由基形成有 关.而近期发现铁蛋白可以快速结合细胞内游离铁, 阻止其通过 Fenton 反应产生羟自由基对细胞的氧 化损伤.因此, 本研究欲证实阿司匹林的抗氧化作 用是通过影响内皮细胞铁代谢`增加铁蛋白表达而 实现的. 阿司匹林的抗氧化作用机制 铁蛋白：铁蛋白是一种贮存铁元素的可溶性蛋白质，铁蛋白占体内储存铁的三分之一，是检测人体体内是否缺铁最灵敏的一项指标。也是检测肝脏是否存在疾患的重要指标之一，也是常见的乙肝（乙型病毒性肝炎）检查项目之一 铁蛋白是铁的贮存蛋白，体内游离 的二价铁可通 过 Fenton 反应催化产生 OH造成细胞 的氧化损伤。 由于铁在生物体内的含量较其他金属元素的总和还多得多，因此。它被看作是这类反应的主要催化因子。而铁蛋白与铁有很高 的结合力 ，l mol 的铁蛋 白可结合 4500 mol的铁，贮存在铁蛋白中的铁是三价形式 ，已丧失催化活性 。因此 ，铁蛋白被看作是铁的生理性螫合剂 ，具有封闭隔离游离铁与活性氧分子的反应 ，是过氧化反应的抑制剂-。而发现阿司匹林具有诱导铁蛋白表达的作用 ，对于解释其在各种炎症及心血管疾病中良好的预防和治疗效果将 有重要得意义。 阿司匹林的抗氧化作用机制 Fenton 反应 过氧化氢与催化剂Fe2+构成的氧化体系通常称为Fenton试剂。在催化剂作用下，过氧化氢能产生两种活泼的氢氧自由基，从而引发和传播自由基链反应，加快有机物和还原性物质的氧化。Fenton试剂一般在pH 3.5下进行，在该pH值时羟基自由基生成速率最大。 氧自由基的作用：氧自由基的过氧化杀伤，主要是破坏细胞膜的结构和功能，破坏线粒体，断绝细胞的能源，毁坏溶酶体，使细胞自溶。同时它对人体的非细胞结构也有危害作用，可以使血管壁上的粘合剂遭受破坏，使完整密封的血管变得千疮百孔，发生漏血、渗液，进而导致水肿和紫癜等等。 实验目的 探究阿司匹林抗氧化作用的机制； 学习内皮细胞的原代与传代培养的方法； 观察不同浓度的阿司匹林在抗H2O2 损伤内皮细胞过程中诱导铁蛋白(Fn) 表达的情况； 培养我们的科研探讨的思维、团结协作和互相交流的能力。 实验材料 I 型胶原酶、TritOn X-100、Ferritin、Apo-ferritin、阿司匹林、消炎痛、水杨酸钠均为Sigma 公司产品；内皮细胞生长因子、Ⅳ型胶原包被的6 孔培养板为Roche 公司产品；细胞因子及内毒素( LPS) 为北京邦定公司产品; M199 培养液( GIBC0 BRL 公司) ；小牛血清、胰蛋白酶、30%H2O2、兔抗人Ⅷ因子血清等为国产制品。 实验方法 人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定, 使用胶原包被的6孔培养板并加入内皮细胞生长因子( 10ng/ml) 进行脐静脉内皮细胞原代培养。待细胞长满2/ 3 板底并融合成单层时进行传代, 接种于22mm×11mm 盖玻片上。倒置显微镜观察细胞呈铺路石样镶嵌单层排列, 鉴定使用辣根过氧化物酶法( PAP 法) 检测Ⅷ因子相关抗原。 实验分组 实验分组使用传2~3 代的内皮细胞进行实验, 分为对照组和实验组。 实验操作 在培养的内皮细胞中加入0.1mmol/L、 0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L的阿司匹林, 孵育24 小时后收获细胞测铁蛋白含量； 仅用1mmol/L 的阿司匹林处理细胞,分别在4、8、16 和24小时收获细胞测定铁蛋白含量； 用0.1mmol/L的去铁胺及50umol/L的FeCl3预先孵育细胞6小时后加入1mmol/L 的阿司匹林,24小时后收获细胞测铁蛋白含量。 实验操作 以上各对照组加入等体积的M199液培养相同时间后收获细胞测铁蛋白。 最后将浓度分别为0.1mmol/L、1.0mmol/L、3.0mmol/L的阿司匹林及1.0mg/ml的Ferritin( 已 饱和铁) 、1.0mg/ml 的apo-ferritin( 去铁蛋白) 加入细胞中预先孵育8小时后, 再加入浓度为0.5mmol/ L 的H2O2 , 对照组仅加入0.5mmol/L的H2O2, 孵育24小时。 实验结束时用倒置