Folin酚比色法测定蛋白质含量.docVIP

Folin-酚比色法测定蛋白质含量 目的 学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法 原理 Folin-酚法，又名Lowry法，所用的试剂由两部分组成：试剂甲为碱性硫酸铜溶液，相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中肽键起双缩脲反应，生成Cu2+-蛋白质络合物；试剂乙为磷钨酸-磷钼酸混合物，在碱性条件下极不稳定，易被上述络合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原成钨蓝和钼蓝。 在一定蛋白质浓度范围内，钨蓝和钼蓝在500nm波长处的光吸收与蛋白质含量成正比，以此可测定蛋白质的含量。 该方法灵敏度高，测定范围为25?g～250?g，比双缩脲法灵敏100倍，用作一般浓度的测定较为适宜，且操作简便、快速，所以是一般实验室中经常使用的方法之一。 注意，酚类物质、柠檬酸、甘氨酸、EDTA、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。 实验材料及设备 材料 绿豆芽 仪器 分光光度计 电子天平 器材 普通试管： 20mL×8 容 量 瓶： 100mL×1 移 液 管： 1mL×4 5mL×1 烧 杯： 250mL×1 50mL×1 滤 纸： ?11 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 坐 标 纸 研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1 试剂的配制 牛血清白蛋白标准液（250?g/mL） 精确称取0.0250g Folin-酚试剂甲 溶液A：Na2CO3 10g NaOH 2g 用蒸馏水溶解后定容至500mL； 酒石酸钾钠 0.25g 溶液B：CuSO4·5H2O 0.05g 用蒸馏水溶解后定容至10mL； 使用前，将溶液A和溶液B以50:1相混合。该混合液只能保持一天。 Folin-酚试剂乙 在1500mL容积的磨口烧瓶中，加入100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、25g钼酸钠(NaMoO4·2H2O)及700mL蒸馏水，再加入50mL 85%正磷酸和100 回流结束后，趁热加入150g硫酸锂、50mL蒸馏水及数滴液体溴，再继续开口沸腾15分钟，以驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色。 用蒸馏水定容到1000mL；过滤；用棕色试剂瓶保存。 使用前稀释1倍，使其最终浓度相当于1N酸。 操作步骤 样品液的制备 取材：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 研磨：将取得的材料置于研钵中，研磨成匀浆。 过滤：将匀浆转移至垫有滤纸的漏斗中过滤，收集滤液；用约10mL蒸馏水分三次洗涤研钵，洗涤液也过滤并收集其滤液。 定容：将滤液用蒸馏水定容到100mL，作为样品待测液。 标准曲线制作及样品测定 取8支试管，按下表所示顺序操作。  管号 操作 空白 标准蛋白浓度梯度 样品 0 1 2 3 4 5 Ⅰ Ⅱ 牛血清白蛋白标准液(mL) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 样品待测液(mL) 1.0 1.0 蒸馏水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Folin-酚试剂甲 各5.0mL 反应 各管混匀，室温下放置10分钟 Folin-酚试剂乙 各0.5mL 反应 及时混匀，室温下放置30分钟 比色 以0号管为空白参比，测定?=500nm处的吸光度 记录吸光度（A500） 结果处理 由0～5号管的数据，以蛋白质含量(?g)为横坐标，A500为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线； 求两个样品管A500的平均值 eq \o(\s\up 9(—),A)500； 由 eq \o(\s\up 9(—),A)500从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(?g)； 计算你所取生物材料中蛋白质的百分含量。