蛋白质印迹法-Western-Blot技术.ppt

Western blot 实验技术 2012.12.12 Western blot的定义 Western blot的基本原理 Western blot的一般流程 Western blot的常见问题 定义 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 Western blot又成蛋白质印迹法，对单项电泳后蛋白质分子的印迹分析称western印迹法，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,且能对蛋白进行定性和半定量的分析方法。 基本原理 Western blot是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色的深度获得特定的蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 一般流程 蛋白质样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 蛋白质样品的制备 从-20℃冰箱取出细胞液，室温溶解后，3000rpm离心5min，吸去上清液，保留细胞沉淀。每管加入一定量的上样缓冲液裂解细胞，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，煮沸10min，使蛋白变性，12000rpm离心5min，取上清，测蛋白含量，用的是TCA蛋白测定法测蛋白含量。 （1）25mg/mL BSA的配制: 取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标 准(20mg BSA)中，充分溶解后配制25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也以-20℃长期保存。 （2）1mg/mL BSA的配制: 取BSA贮备液25mg/mL（0.1mL），用1×loading buffer（2.4mL）稀释至2.5mL，按0.5mL分装成5个包装，标记放入-20℃。 （3）60% TCA工作液的配制: 取2.2g TCA（三氯醋酸）溶于3.67mL双蒸水中，即为60% TCA工作液，使用前配制。 （4）配制BSA标准系列和样品 如表格： BSA（μg） 1mg/mL BSA(μl) 1×loading buffer（μl） ddH2O（μl） TCA（μl） 0 0 50 50 66.7 2.5 2.5 47.5 50 66.7 5 5 45 50 66.7 10 10 40 50 66.7 20 20 30 50 66.7 30 30 20 50 66.7 40 40 10 50 66.7 50 50 0 50 66.7 蛋白样品 5μl，1×loading buffer 45μl，ddH2O 50μl，TCA 66.7μl，放置15-30min，用酶标仪，λ=595nm处测定蛋白含量。 SDS电泳 基本原理： 在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，同时，在强还原剂（beta-巯基乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂。 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合(多肽和SDS的质量比为1:1.4)，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异 。 蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。 因此，蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质亚基分子量的大小。 当蛋白质分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。 电泳步骤： 1.清洗玻璃板 2.灌胶与上样 （1）玻璃板对齐后放在夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶 （2）配置10%的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶至玻璃板高度的2／3处即可，然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（30min）。 （3）当水与胶之间有一条明显的折射线时，说明胶已凝了。等三分钟胶完全凝固后倒去上层水，并用吸水纸将水吸干。 （4）按方法配置5%的浓缩胶，加入TEMED后积极摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中，待浓缩胶凝过后，两手分别捏住梳子的两端竖直向上轻轻将其拔出（一般20分钟时最好拔）。 (5将装置放入电泳槽中，加入足量的电泳液后开始准备上样（电泳液至少漫过小玻璃板内侧） （6）根据测出的蛋白含量，计算出含一定质量蛋白的溶液体积即为上样量。上样前要将蛋白于沸水中煮沸10min使蛋白变性，并12000r／min离心5min。 3.电泳 在浓缩