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第六章 柠檬酸发酵机制 第一节 柠檬酸合成途径 柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。 柠檬酸合成途径： 丙 乙酰COA 葡萄糖 酮 →柠檬酸 酸 草酰乙酸 (参P53图4-1) 黑曲霉能够利用糖类、乙醇和醋酸生成柠檬酸。 Jagnnathan等1953年证实黑曲霉存在EMP途径的所有酶； Ramakrishman 和 Martin 等在1954-1955年间研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环的酶素，证明了黑曲霉存在三羧酸循环。 柠檬酸积累，三羧酸循环阻断，合成柠檬酸所需的草酰乙酸如何得到？ 研究证实：草酰乙酸由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化形成。 PYR+CO2+ATP 草酰乙酸+ADP+Pi Keq=0.818 PEP+CO2+ADP 草酰乙酸+ATP Keq=0.049 碳平衡 由葡萄糖生成柠檬酸的总反应式： 能量平衡 由EMP 途径底物水平磷酸化产生2个ATP，由氧化磷酸化产生9个ATP，可供菌体维持渗透功能等需要，不必再消耗碳源经由TCA循环产生能量。 葡萄糖生成柠檬酸的碳和能量是平衡的 第二节 柠檬酸生物合成的代谢调节 为什么黑曲霉能够大量积累柠檬酸？ 柠檬酸引起反馈调节是如何进行的，而且最终被克服？； 什么机制造成柠檬酸积累？ 一、糖酵解及丙酮酸代谢的调节 1.磷酸果糖激酶（PFK）是第一调节点 在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶（PFK）有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，NH4+能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。 研究表明:NH4+与柠檬酸生产速度有密切关系，正是细胞内NH4+浓度升高，使PFK对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。 比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。 Mn2+的效应是通过NH4+水平升高而减少柠檬酸对PFK的抑制，NH4+水平升高是因Mn2+缺乏使蛋白质和核酸合成受阻。 2.丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。 3.丙酮酸重要分叉点 丙酮酸羧化酶不被乙酰CoA抑制，该酶的调节性差，从而保证了草酰乙酸的提供。 二、三羧酸循环的调节 1. TCA循环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA循环的第一个特点。 3.第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断）。 α-酮戊二酸脱氢酶受葡萄糖和NH4+的抑制，在柠檬酸生成期，菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。 此酶是TCA循环中唯一不可逆反应步骤。这时苹果酸、富马酸、琥珀酸由草酰乙酸生成，这种现象称为TCA循环的马蹄形表达形式。 4.氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。 归纳： ①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑ 有一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链 解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通 ②由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。 ③由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。 ④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。 复习思考题 简述柠檬酸生物合成的代谢调节 柠檬酸积累机制是什么？ 什么是乙醛酸循环？ * * 重点：柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物合成的代谢调节；三羧酸循环的调节； 难点：柠檬酸生物合成的代谢调节；糖酵解及丙酮酸代谢的调节； EMP 氧化脱羧 羧化 丙酮酸羧化酶 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 2.顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶活性在