第十章微生物原生质体育种.pptVIP

微生物原生质体育种的方法 1.微生物原生质体再生育种 2.微生物原生质体诱变育种 3.微生物原生质体转化育种 4.微生物原生质体融合育种 5.其他微生物原生质体育种 2.温度：20~30℃，时间1min~1h。 3.亲株的亲和力和原生质体的活力 4.无机离子： Ca2＋， Mg2＋促进融合； 5.其他条件：细胞密度要在107~109个/mL。 四、融合体再生 （一）融合体再生 双亲融合后形成的融合体不等于重组体，以霉菌来说，可能是异核体或杂合二倍体或者重组体。 融合体的再生，包括融合体细胞壁合成、重建、融合体的再生。 融合原生质体再生的方法： 1、 酵母、细菌：双层平板法 2、放线菌、霉菌：双层平板法，也可以直接分离到高渗培养基平板上。 （二）融合体的检出与分离 1、营养缺陷型标记：双亲带有不同营养缺陷型标记。 2、抗药性：双亲具有不同的抗药性。 3、灭活原生质体：融合前杀死一亲本。 4、荧光染色法：双亲用不用的荧光色素染色标记。 5、双亲对碳源利用不同：要结合其他特性。 6、其他 五、融合重组体检出 （一）重组体的检出和鉴别的方法 1. 直接法 2. 间接选择法 3. 钝化选择法 指用灭活原生质体和具有活性的原生质体融合，灭活的原生质体和营养缺陷型菌株原生质体在基本培养基上都不能生长，只有融合体才能形成菌落。 原生质体灭活的方法可以用加热、紫外线照射或者药物处理等方法。 （二）融合率 1. 直接法的融合率 融合率（%）=基本培养基上再生的菌落数/完全培养基上再生的菌落数×100% 2. 间接法的融合率 融合率（%）=重组体后代总数/所有后代总数×100% 不同微生物的融合率差别很大，如霉菌、放线菌的融合率为0.1%-10%，细菌和酵母为10-3-10-6。异种间融合率比同种间低得多，如霉菌种间融合率为0.1%~1%，酵母、放线菌为10-5-10-7。 （三）DNA含量及孢子形态测定 1. DNA的含量测定：测定孢子、菌丝或细胞的DNA含量，可以进一步帮助鉴别重组体。 2.单倍化：必须连续几代自然分离、纯化，才能获得表型稳定的重组体，也可使用单倍化剂（重组剂）处理。 3. 有关酶活性及孢子体积测定 4. 分子生物学方法： 核酸序列分析与比较。 六、原生质体融合的应用 1、提高产量或质量，合成新物质 2、改良菌种遗传特性 3、优化菌种发酵特性 4、质粒转移 5、原生质体与细胞核融合 6、进行遗传分析 第八节 细菌原生质体融合育种 一、概述 二、细菌原生质融合育种一般程序 三、细菌原生质融合育种技术 （一）培养基与溶液 常用培养基、高渗溶液 （二）细菌原生质融合育种 提高细菌原生质体制备和再生率的方法 预处理；溶菌酶；细菌生理状态；培养基组成与培养条件 建立最佳融合体系 重组子分离模型 （三）操作方法 细菌原生质体的制备方法 细菌原生质体制备率 细菌原生质体再生 原生质体融合 融合体分离与检出 重组体分析和鉴定 第九节 放线菌原生质体融合育种 一、放线菌细胞壁组成和结构及水解 （一）放线菌细胞壁组成和结构 （二）细胞壁水解 水解酶；酶解环境条件 二、放线菌原生质体融合育种 （一）培养基与溶液 （二）菌体培养及预处理 液体培养法；玻璃纸培养法 第十节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母菌细胞壁结构和遗传标记 二、酵母菌原生质体融合技术 （一）出发亲本菌株的筛选及单倍体分离 （二）酵母菌原生质体融合常用培养基与溶液 （三）原生质体制备 （四）原生质体再生 （五）酵母菌原生质体融合 （六）融合重组体鉴定与遗传分析 细胞体积测定；融合子核DNA含量的测定及核型的观察；同工酶分析；重组体交配型鉴定 第十一节 霉菌原生质体融合育种 一、霉菌原生质体融合育种程序 二、培养基及溶液 三、霉菌原生质体融合的关键步骤 （一）霉菌原生质体制备 （二）原生质体的再生 （三）原生质体融合和再生 化学融合法；电融合法；融合体再生与检出 （四）融合重组体分析与鉴定 （三）原生质体制备 （四）原生质体再生 （五）原生质体融合与再生 PEG诱导融合法 电融合法 融合体的检出 思考题 微生物原生质体育种主要包括哪四种手段？ 试述原生质体融合育种的优点及其育种过程和操作要点。 第十章 微生物原生质体育种 第一节 微生物原生质体育种 1953年，Weibull等人首先用溶菌酶溶解细胞壁获得了原生质体。 1958年，Brenner等人提出了细菌原生质体的 3条标准，即没有细胞壁；失去细胞刚性，呈球形；对渗透压敏感。 按照同样的标准，Eddy、Emerson、Bachmann等人用