真核基因表达系统.pptVIP

第八章 真核表达系统 Chapter 8 Eukaryotic expression system;概述( introduction ) 真核基因结构及表达调控特点( Features of eukaryotic gene structure and regulation) 真核表达系统(eukaryotic gene expression system) 酵母表达系统(yeast expression system) 哺乳动物细胞表达系统(mammalian cell expression) 昆虫细胞表达系统(insect cell expression ) ;第一节 概述;一、真核基因组的复杂性; 细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵子，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA； 真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵子的结构。 真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。 ;4. 真核生物基因编码复杂;1、没有转录后的剪接和加工系统 2、缺乏翻译后加工修饰系统：不能进行糖基化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某些蛋白的活性。;3、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定 易被细菌蛋白酶降解; 难实现真正的分泌出胞，其产量很低; 而且容易出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。 表达产物常以包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低 4、内毒素的污染 (contamination of endotoxin);1. 具转录后加工系统: 2. 具翻译后修饰系统 3. 可实现真正的分泌表达 ; （一）真核基因表达调控特点 ---多层次、多方面 （二）真核基因表达的调控模式;真核基因表达的调控模式 ( The regulating model of eukaryotic gene expression) ;1、转录前水平(基因组水平)： gene level 基因结构的改变、稳定持久、不可逆，组蛋白修饰，DNA甲基化等;2. 转录水平调控 顺式调控元件(cis-acting element) 反式作用因子(trans-acting factor) ;（1 ）顺式调控元件(cis-acting element) 结构基因周围能与特异转录因子结合而启动 转录的DNA序列，主要包括： 起正性调节作用：启动子、增强子 起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号; 启动子 位于基因5’末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距离作用、??有方向性、空间位置较恒定。一般包括 核心启动子元件（core promoter elements) ： 指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，决定基因转录的精确起始位点产生基础水平的转录，包括：转录起始点及-30区的TATA-box 上游启动子元件（upstream promoter elements) 包括 -70到-80bp区域的CAAT盒及其两侧的GC盒，协同决定转录的基础效率 组织特异性元件 诱导性启动子元件;真核启动子结构模式图; 哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件 ; 增强子(enhancer) 是一种能够提高转录效率的顺式调控元件 增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动子没有严格的专一性 无方向性（序列、位置） 远距离作用（1-4kB） 无基因特异性 具组织特异性; 沉寂子（silencer)或衰减子（dehancer) 是一类抑制基因转录的调控因子，作用方式 与增强子相同 转录终止信号： 控制基因转录的终止，由polyA上游的10-20bp处的加尾信号（AATAA）和poly A下游的G/T簇构成 ;（2）反式作用因子(trans-acting factor);转录信号1; 3、转录后的修饰 内含子的剪接 外显子的拼接 mRNA的加尾和加帽 mRNA的稳定性; 4、翻译水平的调控 主要是microRNA对mRNA、tRNA 和rRNA的调控;5、翻译后的调控 切除信号肽 糖基化 乙酰化 磷酸化 甲基化 蛋白质的降解;第三节 真核表达系统;真核表达载体;受体细胞; 发酵简单、快速、便宜 真核生物，有翻译后修饰功能 可分泌表达，简化了纯化工艺 受体细胞安全;（一）酵母载体: 1、概念： 携