酶组织化学应用1127.pptVIP

【作用液】0.1M 琥珀酸钠, 0.1M 磷酸盐缓冲液 PH 7.6 NBT(硝基蓝四唑), 二甲亚砜(DMSO) 【步骤】 1. 新鲜组织低温冰冻切片 2. 作用液15~35 分钟 3. 生理盐水洗 4. Fca(氯化钙Formalin)固定10分钟 5. 入80%乙醇5分钟 6. 甘油明胶封固或脱水、透明、中性树胶封片 【结果】酶活性处为蓝紫色沉淀 小鼠心肌冰冻切片-琥珀酸脱氢酶 X400 2. 乳酸脱氢酶（LDH） 需辅酶的脱氢酶 广泛分布的可溶性酶，为糖原分解的酶系 最适PH 7.4 肝、骨骼肌的酶活性高于心肌 【基本原理】催化乳酸和丙酮酸的互变反应 乳酸盐 + NAD 丙酮酸盐 + （NADH+H+） LDH （辅酶Ⅰ） （还原型辅酶Ⅰ） （二）过氧化物酶 催化各种物质被过氧化氢（H2O2）所氧化 见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等 髓过氧化物酶见于中性和嗜酸性白细胞及其前体细胞中，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要 免疫组化中常用辣根过氧化物酶（HRP）作为大分子示踪剂 【显示方法】二氨基联苯胺法示过氧化物酶 【基本原理】过氧化物酶作用于底物（3，3-二氨基联苯胺，DAB），催化底物被H2O2氧化，生成棕色的沉淀 【作用液】DAB，Tris-cl缓冲液， H2O2 【结果】酶活性处呈棕色 小鼠腹腔巨噬细胞-过氧化物酶 *400 白血病涂片-过氧化物酶 X400 * 酶组织化学的应用 姜玉峰 石河子大学医学院组胚教研室 酶组织化学基本反应原理 酶作用底物 + 相关化学试剂 反应产物沉淀↓（有色） 酶 （孵育液内） （组织细胞内） （镜下观察） 显示酶的组织化学方法 1.金属沉淀法：磷酸酶的显示 甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅 硫化铅 2.偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方法 3.电子传递法：氧化酶和脱氢酶的显示 酸性磷酸酶 底物 酶 初级反应产物（PRP） 重氮盐 最终反应产物（FRP） （一）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP） 又称碱性磷酸单酯酶（EC3.1.3.1） 在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解 最适PH 9.2-9.4 激活剂: 如Mg++, Mn++, 某些氨基酸等 抑制剂: 氰化物、砷酸盐等 （一）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， AKP） 分布：广泛存在于机体组织，常见于具有活跃转运功 能的细胞膜内，如毛细血管及毛细血管动脉部分的内皮细胞，肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹状缘; 应用：1. 肝脏病、白血病的研究诊断; 2. 骨的发生和代谢疾病; 显示碱性磷酸酶的常用方法: 1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法) 【基本原理】 甘油磷酸钠 磷酸酯+Ca++ 磷酸钙 磷酸钴 硫化钴 【孵育液】 孵育液的成分： 3% β-甘油磷酸钠 10 ml 2% 巴比妥钠 10 ml 2% CaCl2 20 ml 5% MgSO4 1 ml 双蒸水 5 ml AKP 显示碱性磷酸酶的常用方法: 1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法) 【操作步骤】 1. 新鲜组织低温冰冻切片 2. 不固定切片直接进作用液, 或用1%氯化钙固定5 分钟-2小时, 4℃, 蒸馏水洗 3. 作用液10-60分钟, 37℃ 4. 蒸馏水洗 5. 2%硝酸钴1分钟 6. 蒸馏水洗 显示碱性磷酸酶的常用方法: 1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法) 【操作步骤】 7. 1~2%硫化铵1分钟 8. 蒸馏水洗 9. 甘油明胶封片, 或脱水, 透明, 中性树胶封片 【结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀 肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法 X100 肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法 X200 2. 偶氮偶联法