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四、间接法 此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。 基本原理:将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。 ①特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合抗原及杂质； ②加待测血清，血清中若有相应的抗体则与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤后，固相载体上仅剩下特异性抗体。其他免疫球蛋白及杂质不能与固相抗原结合被去除； ③加酶标抗免疫球蛋白（酶标抗抗体）与固相复合物中的抗体相结合。洗涤后，固相载体上的酶量与待测血清中特异性抗体的量相关。若欲测人对某种病原微生物的抗体，可用酶标记羊抗人IgG抗体； ④加入底物显色，颜色深浅代表样本中待测抗体量。 五、竞争法 方法和特点: ①酶标记抗原（抗体）与样品或标准品中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体（抗原）结合的能力；? ②测定管中加入待测样本与一定量酶标抗原（抗体）的混合溶液，使两者竞争性的与固相抗体（抗原）反应； ?③免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性）与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比。 ④可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 六、捕获法测IgM抗体 先将针对IgM的第二抗体连接于固相载体，用以结合（“捕获”）样品中所有IgM（特异或非特异），洗涤除去IgG等无关物质，然后加入特异抗原与待检IgM结合；再加入抗原特异的酶标抗体，最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体复合物，加酶底物作用显色后，即可对样品中待检IgM是否存在及其含量进行测定。 ①抗-μ链（或抗-IgM抗体）包被在固相上，形成固相抗-μ链（或抗-IgM抗体），洗涤； ②加入稀释待测样本，样本中所有的IgM与抗-μ链结合，洗涤除去未结合物质；③加入特异性抗原，它只与固相上特异性的IgM结合。洗涤； ④加入针对特异性抗原的酶标抗体，使之与结合在固相上抗原结合，洗涤； ⑤加底物显色，若有颜色显示，则表示待测样本中有特异性的IgM抗体存在。 七、中和法 常用于已知中和抗原检测样本中的未知抗体。 在固相上包被已知抗体，当检测样本中含有待测抗体时，与反应体系中加入的中和抗原结合，反应过程不能形成“抗体-抗原-酶标记抗体”复合物，加入底物不显色，实验结果判为阳性；当检测样本中无待测抗体时，加入的中和抗原则与固相抗体结合，形成“抗体-抗原-酶标记抗体”免疫复合物，加入底物显色，实验结果判为阴性。 固相酶免疫测定的技术要点 ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液 试剂的准备 固相载体：最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯吸附蛋白质的能力较强，抗体或蛋白质抗原吸附其上并保留原来的免疫活性。载体的性状主要有三种：小试管、小珠和微量ELISA板。 抗原和抗体：所用抗原要求纯度高，抗体效价高，结合力强。 酶和底物： ELISA中最常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶 酶和酶作用底物要求 活性高 有可结合的基团，不影响抗原抗体的免疫活性 反应产物易于判定或测量，方法简单,敏感,重复性好 酶活性不受样品中其他成分的影响,在均相酶免疫测定抗原抗体反应后酶活性可被抑制或激活 本身及产物无危害,性质稳定,价廉易得 常用酶及酶的底物 DH2 + H2O2 → D + 2H2O 底物 受氢体 E 有色物质 辣根过氧化物酶 (HRP) 邻苯二胺(OPD) 灵敏度高,比色方便，稳定性差,避光,致癌 四甲基联苯胺(TMB) 稳定性好,无致突变作用，水溶性差 碱性磷酸酯酶 (AP) 底物: 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 产物: 黄色的对硝基酚 β-半乳糖苷酶 (β-Gal) 底物: 4-甲基伞酮基-β-D-半乳糖苷(4MuG) 产物: 4-甲基伞形酮(荧光计测量) 酶 底物 显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺 橙黄色 492 四甲基联苯胺 黄色 450 氨基水杨酸 棕色 550 2,2‘-氨基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 蓝绿色 642 　 　 　 碱性磷酸酯酶 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 黄色 405 β