极端耐受体系的构建.pptVIP

目录 一、研究内容与目标 二、总体实验方案 三、实验步骤 一、研究内容与目标 1. 建立能够耐受高浓度乳酸、盐酸、低pH值、高浓度甲醇、稀土的培养 体系。并且不断的通过诱变和genome shuffling的办法提高体系的耐受 能力。 2. 从建立的体系中筛选能够耐受高浓度上述条件的菌株，进行菌株鉴定 和能力分析，当然也可以直接从天然环境中分离鉴定菌株（如耐受稀 土或者是高浓度有机物质的菌株） 3. 建立的耐受菌种库相当于庞大的耐受模块库，从耐受体系中直接克隆 各种耐受基因，直接用于表达构建耐受力提高的菌株。或者利用分子 进化的手段进一步提高耐受基因的能力，筛选高能力的模块用于构建 耐受力提高的菌株。 二、总体实验方案 1.耐乳酸体系的构建（不同浓度的乳酸和pH值） 2.耐乳酸和低pH值的菌株的筛选和鉴定。 3.耐甲醇体系的构建 4.耐受和利用高浓度甲醇的菌株的筛选和鉴定。 5.耐受稀土的菌株的筛选和鉴定。 三、实验步骤 1. 在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约 100g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。（或者用市售酸菜，酱菜） 2. 取15个广口瓶编号为1-15号，每瓶分装100ml培养基。1-3号瓶添加 2ml乳酸，pH分别调节到2、3、4；4-6号添加4ml乳酸，pH分别调节 到2、3、4；7-9号瓶添加6ml乳酸，pH分别调节到2、3、4；10-12号 瓶添加8ml乳酸，pH分别调节到2、3、4；13-15号瓶添加10ml乳酸， pH调节到2、3、4. 3. 每瓶中加入5g样品，封口后室温静置培养，每隔12小时搅拌一次，注 意补充营养，保持pH稳定。 4. 培养3天后再取15个广口瓶，设定同样的培养条件，编号同上。A）从上一批中分别取样5ml（从培养液中5个不同的位置各取样1ml）依次接种到这一批次中，室温静置培养、观察。(每3天转接一次，培养条件不变)B）取完样的剩余培养液中补充营养，每12个小时向培养液中滴加适量HCl，添加已知量的乳酸，缓慢的改变培养基环境至下一个耐受梯度，此后每三天转移一次。驯化至所期望的耐受值后保藏、建立相应的菌种库。 5. 不生长的瓶子应做记录，记下编号并重新做一个此编号的广口瓶培养系统，将此编号前一编号的瓶中取样做适当处理后（shuffling）再接种到此新瓶中，静置培养，观察生长情况。 6.（与3同步进行）以2%乳酸含量、pH=4为例：首先封口室温静置培养，及时搅拌；培养过程中注意补充营养、保持pH稳定，培养3天后向培养液中滴加HCl，添加已知量的乳酸，缓慢的改变培养基环境，达到驯化的目的，保藏合适的耐受梯度、建立相应的耐受菌种库。 极端耐受体系的构建 苌豹 2012.10.16 Thank You