分子生物学在医学研究中具体应用.pptVIP

为了方便筛选可将一个基因载体上构建亮 氨酸表达基因，以便使含两个共转染质粒的 酵母菌能在无亮氨酸的培养基上生长。 也可用此DNA序列为探针，从cDNA文库中筛选出具有全长DNA序列的基因，将此基因在大肠杆菌或细胞中表达后再用体外蛋白质结合后共免疫沉淀等进一步检定两个蛋白之间的相互作用 转基因动物技术的应用 (1)基因组或阶段特异表达的研究 (2)通过研究转入外源基因后的新型可以发现基因的新功能 (3)导入外源基因后，由于基因的随机插人，可能会导致内源基因的突变，这些突变表型的分析，可以发现新的基因 (4)可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究 (5)可以建立研究外源基因表达、调控的动物模型 (6)可用于遗传性疾病的研究 (7)探讨生殖细胞的基因治疗方法或建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据 (8)可用于动物新品种的培育 (9) 可用于病毒性疾病的研究 (10)基因工程药物生产。在转基因动物药物生产方面的关键技术是外源目的基因在特定靶器官的特异表达。如将外源性人凝血因子基因转入牛或羊中使其在乳腺组织中特异表达，从而可从乳汁中提取出凝血因子用于疾病的治疗。 七. 动物克隆技术 克隆译自英文“clone”，基础医学领域与克隆 定义有关的内容有三个。 细胞单克隆抗体技术：指通过将骨髓瘤细胞 与鼠免疫细胞融合后，筛选出能产生某种抗 体的细胞系的技术。 基因克隆是指将目的基因获取并通过载体转 移入宿主细胞使其增殖表达的过程 动物克隆是不经过有性生殖过程，而是通过 核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物 个体的技术。 开始人们将成年动物(羊)的体细胞核分离出来，移植入除去了细胞核的卵母细胞中，再放回母体子宫中培育成功了第一代克隆动物。进而人们又将体细胞中的染色体提取出来注射入去除细胞核的卵细胞中也成功地培育出了克隆动物。现在克隆羊、克隆牛、克隆兔等都已完成。第一代克隆羊又成功地产出了小羊，证明克隆动物与自然受孕的动物在遗传信息的传递及发育等力面完全相同。 克隆之父—伊恩·维尔穆特 克隆羊多利 动物克隆技术的应用 (1)复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源，对濒危物种的繁衍有重要意义。如我国正在开展克隆大熊猫的研究 (2) 培育优良畜种和生产实验动物 (3) 生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法 八.从鼠源性到人源性抗体 鼠源性单克隆抗体已广泛应用于疾病的体外诊断中，但因其来源于鼠当在人体内应用时由于存在抗原性容易导致针对其抗体的产生，所以在长期用药时因被体内产生的抗体中和而失去作用。再者鼠源性抗体为异种蛋白，所以容易引起过敏反应。80年代初期开始了基因工程抗体的研究，采用基因工程技术对鼠单抗进行结构改造，构建了单链抗体，嵌合抗体，人源化抗体等。 单链抗体是由抗体重、轻链的可变区基因(VH、VL)之间通过一段编码连接肽基因拼接后表达形成的重组蛋白，具有分子量小易穿透组织等优点，但无Fc端效应功能。 嵌合抗体是在基因水平上连接小鼠抗体V区和人抗C区并在转染细胞中表达。嵌合抗体虽然已经减少了抗鼠抗体的产生，但是其整个V区仍然全部是鼠源性的，自然可被人体免疫系统识别而产生抗鼠抗体。 利用基因工程技术，将人抗体可变区中互补决定簇(CDR)序列改换成鼠源单抗CDR序列，构建出即保留鼠源性单抗的特异性与亲和力又减少了对人抗原性的重构型抗体，又称CDR移植抗体或改型抗体。 目前已构建了30余种针对不同抗原的Rab，有些已应用于临床诊治，并取得了令人满意的效果。如消除肿癌、延长器官移植生存期，改善类风湿关节炎，感染性疾病及免疫紊乱性疾病等。美国FDA已批准治疗乳腺癌的人源化抗体Herceptin上市。 构建人源化抗体常常达不到原先鼠单抗的亲和力。人们开始于90年代初利用抗体组合文库技术制备完全人源性的单克隆抗体。 利用组合抗体库技术已成功制备了抗乙肝表面抗原(HbsAg)的Fab段。 九. 利用酵母菌双杂合系统确定相互作用的蛋白质 许多生物学活动包含生物大分子之间的相互作用，如蛋白质-蛋白质；蛋白质-核酸之间的反应。经典的研究蛋白质-蛋白质结合的方法包括亲和层析法，受体配体结合试验，用这些方法很难得到稀有的相互作用蛋白。 90年代以来新发展了一种从基因水平上研究蛋白质-蛋白质相互作用的酵母双杂交系统，为相互作用蛋白的研究提供了有效的方法。目前已用此方法发现了许多有生物学意义的相互作用蛋白质。 酵母菌双杂合系统的基本原理 许多转录活化因子都含有两个分开的结构：结合区(Binding domain, BD)和活化区(Active domain, AD)，结合区可与基因上游的启